一种针对斑马鱼胚胎中Pseudomonas aeruginosa感染的噬菌体疗法

摘要

来源：Cafora, M.，等，A. 噬菌体疗法在囊性纤维化斑马鱼胚胎中抗Pseudomonas aeruginosa感染的应用。J. Vis. Exp. (2020)

该视频展示了针对囊性纤维化斑马鱼胚胎中Pseudomonas aeruginosa感染的噬菌体治疗技术。噬菌体治疗可有效降低细菌载量，并减轻感染细菌的囊性纤维化斑马鱼胚胎中的促炎性免疫反应，从而降低囊性纤维化胚胎的死亡率。

方案

1. 斑马鱼胚胎的细菌与噬菌体混合物显微注射

注意： 若要进行全身感染，胚胎必须具备血液循环，而血液循环通常在受精后26小时开始。

1. 在26 hpf后，使用由蛋白酶K粉末溶于E3培养基中配制的pronase溶液（终浓度为2 mg/mL）去除胚胎的绒毛膜。轻轻吹打胚胎以破坏绒毛膜。弃去含pronase的E3培养基，并用新鲜E3培养基多次冲洗培养皿，彻底去除所有pronase。
2. 在注射前约5分钟，将斑马鱼胚胎置于含有Tricaine的E3培养基中进行麻醉。
3. 用移液器将麻醉后的胚胎转移至步骤1中准备好的轨道内。使用细小的凝胶上样枪头将胚胎排列成侧卧位。
4. 用移液器吸取约5 μL的P. aeruginosa菌液，装入显微注射针中。
5. 从胚胎背部插入注射针，至Cuvier氏管起始处，即位于卵黄囊上方开始扩散的位置。注射1–3 nL体积，确保液体直接进入Cuvier氏管并流入循环系统。
6. 每注射约50个胚胎后，取一滴细菌悬液注入含100 μL无菌PBS的1.5 mL离心管中，以检测注射体积是否保持恒定。将接种物在LB琼脂平板（见表1）上37 °C过夜培养，测定CFU数量。
7. 将完成显微注射的胚胎转移至两个洁净的培养皿中，每个培养皿内含新鲜E3培养基加PTU（表1），并在28 °C下孵育。
8. 在两个选定的时间点：细菌注射后30分钟或3小时，从孵箱中取出一个含有细菌注射胚胎的培养皿，按照步骤6.3所述方法将其在轨道中排列整齐，用于噬菌体混合液的注射。
9. 使用细小的凝胶上样枪头吸取约5 μL噬菌体混合液（包含四种可感染PAO1菌株的噬菌体混合物），装入显微注射针中，并将其固定至显微注射仪。
10. 将噬菌体混合液注射至先前已注射细菌的胚胎的Cuvier氏管中。
11. 将完成噬菌体注射的胚胎转移至两个洁净的培养皿中，每个培养皿内含新鲜E3培养基加PTU，并在28 °C下继续孵育。

表1：溶液的配制

溶液	配制方法
Anaesthetic stock solution 25X	4 mg/mL Tricaine 溶于蒸馏 H2O 中。
Anaesthetic working solution 1X	将 25X Tricaine 储存液用蒸馏 H2O 稀释至 1X 浓度（0.16 mg/mL Tricaine 的蒸馏 H2O 溶液）。
CsCl d=1.3	20.49 g 溶于 50 mL TN 缓冲液中
CsCl d=1.4	20.28 g 溶于 50 mL TN 缓冲液中
CsCl d=1.5	34.13 g 溶于 50 mL TN 缓冲液中
CsCl d=1.6	41.2 g 溶于 50 mL TN 缓冲液中
斑马鱼胚胎用 E3 胚胎培养基（1X）	1 L 1X E3（将 50X 储存液用蒸馏 H2O 稀释） + 200 μl 0.05% 甲基蓝。室温保存。
E3 胚胎培养基储存液（50X）	73.0 g NaCl、3.15 g KCl、9.15 g CaCl2 和 9.95 g MgSO4 溶于 5 L 蒸馏 H2O 中。室温保存。
LB 琼脂	10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，5 g/L NaCl，10 g/L 琼脂
LB 肉汤	每升：950 mL H2O，10 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，5 g 酵母提取物
PBST	1X PBS + 1% Triton X-100
生理溶液	0.9% NaCl
色素形成阻断储存液（10X）	0.3 mg/mL 苯硫脲（PTU）粉末溶于斑马鱼胚胎用 E3 胚胎培养基中
Pronase 储存液（5X）	5 mg/mL Pronase 粉末溶于斑马鱼胚胎用 E3 胚胎培养基中
TN 缓冲液	10 mM Tris HCl（pH 8.0），150 mM NaCl

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌琼脂	BD	214010
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 PBS	Sigma-Aldrich	D8537
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	886-86-2	通用名 三卡因
Femtojet 显微操作仪	Eppendorf	5247
显微注射针	Harvard apparatus
N-苯基硫脲 >=98%	Aldrich-P7629	103-85-5
蛋白酶 Pronase	Sigma-Aldrich	9036-06-0
Z-MOLDS 显微注射模具	Word Precision Instruments