一种针对斑马鱼胚胎中Pseudomonas aeruginosa感染的噬菌体疗法

摘要

来源：Cafora, M.，等，A. 噬菌体疗法在囊性纤维化斑马鱼胚胎中抗Pseudomonas aeruginosa感染的应用。J. Vis. Exp. (2020)

该视频展示了针对囊性纤维化斑马鱼胚胎中Pseudomonas aeruginosa感染的噬菌体治疗技术。噬菌体治疗可有效降低细菌载量，并减轻感染细菌的囊性纤维化斑马鱼胚胎中的促炎性免疫反应，从而降低囊性纤维化胚胎的死亡率。

方案

1. 斑马鱼胚胎的细菌与噬菌体混合物显微注射

注意： 若要进行全身感染，胚胎必须具备血液循环，而血液循环通常在受精后26小时开始。

1. 在26 hpf后，使用由蛋白酶K粉末溶于E3培养基中配制的pronase溶液（终浓度为2 mg/mL）去除胚胎的绒毛膜。轻轻吹打胚胎以破坏绒毛膜。弃去含pronase的E3培养基，并用新鲜E3培养基多次冲洗培养皿，彻底去除所有pronase。
2. 在注射前约5分钟，将斑马鱼胚胎置于含有Tricaine的E3培养基中进行麻醉。
3. 用移液器将麻醉后的胚胎转移至步骤1中准备好的轨道内。使用细小的凝胶上样枪头将胚胎排列成侧卧位。
4. 用移液器吸取约5 μL的P. aeruginosa菌液，装入显微注射针中。
5. 从胚胎背部插入注射针，至Cuvier氏管起始处，即位于卵黄囊上方开始扩散的位置。注射1–3 nL体积，确保液体直接进入Cuvier氏管并流入循环系统。
6. 每注射约50个胚胎后，取一滴细菌悬液注入含100 μL无菌PBS的1.5 mL离心管中，以检测注射体积是否保持恒定。将接种物在LB琼脂平板（见表1）上37 °C过夜培养，测定CFU数量。
7. 将完成显微注射的胚胎转移至两个洁净的培养皿中，每个培养皿内含新鲜E3培养基加PTU（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌琼脂	BD	214010
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 PBS	Sigma-Aldrich	D8537
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	886-86-2	通用名 三卡因
Femtojet 显微操作仪	Eppendorf	5247
显微注射针	Harvard apparatus
N-苯基硫脲 >=98%	Aldrich-P7629	103-85-5
蛋白酶 Pronase	Sigma-Aldrich	9036-06-0
Z-MOLDS 显微注射模具	Word Precision Instruments