大鼠离断跟腱内注射富含血小板血浆

摘要

来源：Greimers, L.，等。同种异体富血小板血浆（PRP）对大鼠离断跟腱愈合过程的影响：方法学描述。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种将富血小板血浆（PRP）注射到大鼠离断的跟腱部位的技术。首先从受体大鼠的跟腱上切除一小段组织，对切口部位进行缝合，并让大鼠恢复。与此同时，从供体大鼠采集全血，经离心获得富血小板血浆（PRP），随后将其激活并注射至受体大鼠的缝合部位，以诱导跟腱修复。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物准备

1. 使用132只体重为320–450 g的2月龄雄性Sprague-Dawley大鼠（其中120只用于实验，12只用于采血，图1）。每组15只大鼠即可达到0.8的检验效能（若存在指定效应，有80%的概率发现统计学显著性）。
2. 将所有大鼠饲养于传统笼具中，在配备更衣站的普通设施内实施隔离饲养。在独立通风笼具（IVC）架中进行繁殖，特定无病原体（SPF）级大鼠需专门采购。
3. 采用以下饲养条件：温度范围19–24 °C；相对湿度：40–60%；通风：换气频率每小时10–15次；光照/黑暗周期：12小时光照–12小时黑暗。
4. 对所有笼具设备进行灭菌，并使用辐照垫料。通过在笼内放置无菌纸板托盘和毛巾，系统性实施笼内环境丰富化措施。
5. 限制人员进入该区域，进入时须穿戴新的实验服、口罩、手套、鞋套和头帽。
6. 根据Felasa对普通设施的建议，每年对饲养在污染垫料上的哨兵动物进行群体健康监测。每笼饲养4至5只动物，提供适当的辐照饲料，并自由饮用酸化水ad libitum。每日进行监测。
7. 在手术前2小时，将选定接受手术干预的大鼠转移至过滤顶笼，并送入手术室。

2. 手术步骤

1. 准备手术器械：精细剪刀、钳子、两个止血钳和持针器。所有操作过程中，均需佩戴手套、口罩、头罩和实验服。
2. 将大鼠随机分为两组（PRP组和生理盐水组）。
3. 将大鼠从笼中取出并称重。使用编号耳标标记大鼠。为防止角膜干燥，需在角膜上滴加水滴。
4. 通过腹腔注射给予赛拉嗪（10 mg/kg 体重）和氯胺酮（80 mg/kg 体重）对大鼠进行麻醉。将动物置于心肺功能监护仪下，确认麻醉状态，并检查瞳孔反射。
5. 在颈部皮下注射50 µL布托啡诺（0.01–0.05 mg/kg，每8–12小时一次）作为镇痛剂。
6. 使用电动剃毛器剃除左侧后肢的毛发，用等比稀释（1:10）的碘伏/酒精溶液交替擦拭三次进行消毒，然后将大鼠置于解剖显微镜下的保温垫（20 °C）上。使大鼠侧卧，待手术腿位于上方位置，并用手术镊固定足掌。
7. 使用剪刀在左跟腱周围皮肤做一小的侧向切口（20–25 mm），并用精细剪刀分离筋膜，暴露跟腱复合体（图2a）。
8. 用剪刀切除趾长屈肌腱（图2b）。
9. 在跟腱止点近端5 mm处横向切断跟腱，并用剪刀移除一段5 mm长的组织。不缝合跟腱（图2c, 2d）。
10. 使用可吸收缝线缝合筋膜和皮肤，采用连续缝合方式（覆盖缝合）。单丝缝线还可防止液体从皮肤向手术切口处虹吸。
11. 将大鼠置于加热灯下直至苏醒，然后将其放回笼中（58 × 38 cm）（Nota bene：不施加任何固定措施）。

3. PRP 的制备

1. 通过腹腔注射给予供体大鼠赛拉嗪（10 mg/kg 体重）和氯胺酮（80 mg/kg 体重）进行麻醉。术后2小时直接进行PRP注射，无需再次麻醉。
2. 皮下注射50 µL丁丙诺啡作为镇痛剂。
3. 通过心脏穿刺采集全血（每只大鼠20 mL，终末放血），收集至含有3.2%缓冲柠檬酸钠（0.109 M，抗凝剂）的无菌试管中。随后通过心内注射实施安乐死。
4. 为获得富血小板血浆（PRP），将血液在室温下以150 × g离心10分钟。此初始低速离心步骤产生两个明显分层：下层为红细胞（RBCs），约占总体积的80–90%；上层为富血小板血浆（PRP），通常占血样总体积的10–20%。
5. 使用塑料移液管将PRP（上层）转移至另一塑料管中。由于PRP与红细胞之间的界面非常松散，移液时切勿过于接近界面。若操作得当，PRP中污染的红细胞应低于0.05 × 10³ 个/µL。弃去剩余的下层液体及原始采血管。
6. 测定所收集PRP的体积，并使用血液学分析仪测量血小板计数。这些数值用于下一步调整血小板浓度的计算。同时进行血细胞计数有助于评估红细胞和白细胞的潜在污染情况。此阶段PRP中的血小板浓度通常为1 – 1.5 × 10⁶/µL。
7. 将PRP在室温下以1,000 × g再次离心10分钟。此高速离心步骤形成松散的血小板沉淀及上清液——自体贫血小板血浆（PPP）。根据步骤3.6中测得的数值，计算需弃去的上清液体积，以浓缩PRP并达到最终浓度2.5 × 10⁶/µL。
8. 使用塑料移液管小心吸取上清液（PPP）至另一塑料管中，保留约三分之二步骤3.7计算所得的最终体积。由于沉淀松散，弃去PPP时会损失大量血小板，可能导致目标浓度降低。
9. 用剩余上清液通过轻柔反复吹打，仔细重悬血小板沉淀。对浓缩后的PRP进行血小板计数。如有需要，加入适量自体PPP以达到目标终浓度。
   注意：PRP应在制备后3小时内使用。
10. 每毫升PRP中加入50 µL氯化钙（CaCl₂，11 mEq/10 mL）以激活血小板。
11. 在制备后约1小时，使用21G针头将50 µL新鲜PRP或生理盐水直接注射至缝合的手术部位。在此期间，PRP应置于室温保存。
12. 术后数日内密切监测大鼠功能恢复情况，直至跟腱取出前。

结果

图1：研究的实验设计。

图2：手术过程。

（a）去除周围筋膜后的肌腱复合体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
赛拉嗪（Xyl-M）	VMD	无	麻醉剂
氯胺酮（Jétamine 1000 CEVA）	CEVA Santé Animale	无	麻醉剂
布托啡诺（Vetergésic Multidosis）	ALSTOE	无	镇痛药
碘伏（iso-Betadine）	MEDA-Pharma	无	消毒剂
可吸收缝线Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
戊巴比妥钠（Nembutal）	CEVA Santé Animale	无	麻醉剂
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	保存组织结构
异丙醇 100%	VWR	2,09,22,364
乙醇 95%	VWR	2,08,23,362
二甲苯	VWR	28973.363
石蜡	VWR	LEIC3950.1006
苏木精	Millipore	1.15938.0025	染色剂
伊红	Millipore	1.15935.0100	染色剂
Eukitt	Sigma-Aldrich	3989	封片介质
CaCl2