用于疫苗接种的mRNA负载纳米颗粒的制备

摘要

来源：Fornaguera, C. 等，用于疫苗接种目的的mRNA负载聚（β-氨基酯）纳米颗粒的合成与表征 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了一种利用聚合物纳米颗粒制备mRNA疫苗候选物的方法。阳离子聚合物与带负电荷的mRNA相互作用，形成聚集体（polyplexes）。聚集体的形成可稳定mRNA，使其成为免疫治疗应用中未来mRNA疫苗的潜在候选物。

方案

1. 带末端寡肽的聚（β-氨基酯） （OM-pBAE）聚合物的合成

1. 聚合 C6-pBAE
   1. 将 5-氨基-1-戊醇（38 mmol；分子量 = 103.16 Da）和 1-己胺（38 mmol；分子量 = 101.19 Da）加入圆底玻璃烧瓶（100 mL）中，然后加入 1,4-丁二醇二丙烯酸酯（82 mmol；分子量 = 198.22 Da）。
   2. 将硅油浴预热至 90 °C，将圆底烧瓶置于油浴中，并借助磁力搅拌子搅拌混合物过夜（约 18 小时）。然后将产物从圆底烧瓶中取出，并在 -20 °C 冰箱中冷冻。
      注意： 产物呈粘稠粉末状，需借助刮刀从烧瓶中取出。必须通过 ¹H-NMR 验证所得聚合物的结构。核磁共振谱在 400 MHz 仪器（见 材料表）中测定，使用氘代氯仿和 D₂O 作为溶剂。取约 10 mg 每种聚(β-氨基酯)，溶解于 1 mL 氘代溶剂中。
2. 与多肽反应制备 OM-pBAE
   1. 将 25 mL 0.1 M 盐酸加入选定的多肽（例如 Cys-His-His-His 多肽）中，加入三氟乙酸（TFA，200 mg），置于预先称重的 50 mL 离心管中（该离心管需可耐受冻干），手动搅拌过夜，以获得澄清溶液。
   2. 在 -80 °C 下冷冻溶液 1 小时，随后冻干得到多肽盐酸盐。
      注意：检查最终重量是否与理论值相符。
   3. 将 C6-pBAE（0.031 mmol）溶于二甲基亚砜，配制成溶液。同时将多肽盐酸盐（0.078 mmol）溶于二甲基亚砜，配制成另一溶液。
   4. 将两种溶液混合于螺口管中，拧紧盖子。将混合溶液置于温度控制为 25 °C 的水浴中，用磁力搅拌子搅拌 20 小时。
   5. 将混合物加入 7:3（v/v）乙醚/丙酮混合液中。在 4 °C 下以 25,000 x g 离心，以去除溶剂。随后，用 7:3（v/v）乙醚/丙酮洗涤沉淀物两次。然后在真空条件下干燥产物（<0.2 atm）。
   6. 将产物以 100 mg/mL 的浓度溶于二甲基亚砜中。所得产物命名为 C6-多肽-pBAE。必须通过 ¹H-NMR 验证所得聚合物的结构，以确认末端丙烯酸酯相关的烯烃信号消失。若不立即使用，可将聚合物在 -20 °C 下冷冻保存。

2. 聚合物复合物的形成

注意：所有操作均应在温控室内进行，以保持恒定的温度。

1. 解冻聚合物 C6-肽-pBAE 并涡旋溶液。
2. 用移液器反复吹打聚合物混合物，并在醋酸钠（NaAc）中配制 12.5 mM（V₁）的溶液。然后涡旋混合物并静置 10 分钟。
3. 将信使核糖核酸（mRNA）配制成 0.5 mg/mL 的溶液，并通过移液吹打混合（V₂）。
   注意：切勿涡旋 mRNA 溶液。
4. 涡旋聚合物混合物至最终浓度，以使聚合物的二甲基亚砜（DMSO）储备液与醋酸盐缓冲液充分混匀，形成均一溶液。
   注意：最终聚合物浓度取决于所选的 N/P（氮/磷酸基团）比。N/P 比取决于所使用的特定 mRNA。例如，在封装增强型绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA 时，如先前报道，采用 25:1 的比例。
5. 将遗传物质溶液与 C6-肽-pBAE 溶液（浓度为 mRNA 的 25 倍）按 1:1 的比例混合（V_i = V₁ + V₂）。
   注意：C6-肽-pBAE 装于微量离心管中，通过上下移液将 mRNA 加入并混合。一旦配制完成，聚复合物（polyplex）中核酸和 C6-肽-pBAE 的浓度均被稀释一半。
6. 在 25 °C 的温控金属块中孵育 30 分钟。通过将样品加入预先装有 RNase-free 水的微量离心管中，按 1:2 的比例进行沉淀。
7. 加入辅料。用移液器上下吹打，加入与 mRNA 和 pBAE 混合物体积相等的 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 4% 蔗糖溶液（体积为 V_i）。此时，样品总体被稀释了 3 倍。

3. 聚合物复合物的冻干

1. 将先前的聚集体溶液立即置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻 1 小时。
2. 按以下步骤进行初次干燥：（1）-60 °C、0.001 hPa 条件下 1 小时；（2）-40 °C、0.0001 hPa 条件下 1 小时；（3）-20 °C、0.0001 hPa 条件下 4 小时；（4）5 °C、0.0001 hPa 条件下 12 小时。
3. 立即于 -20 °C 保存，以避免使用前重新吸水。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4-丁二醇二丙烯酸酯	Sigma Aldrich	123048
1-己胺	Sigma Aldrich	219703
5-氨基-1-戊醇	Sigma Aldrich	411744
丙酮	Panreac	141007
氯羟化物	Panreac	181023
氘代氯仿	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-His 肽	Ontores	定制
Cys-Lys-Lys-Lys 肽	Ontores	定制
D2O	Sigma Aldrich	151882
DEPC 试剂（用于制备无 RNase 水）	Sigma Aldrich	D5758	该试剂用于处理 MilliQ 水以去除缓冲液中的任何 RNase
乙醚	Panreac	212770
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
mRNA EGFP	TriLink Technologies	L-7601
RiboGreen 试剂盒	ThermoFisher	R11490
乙酸钠	Sigma Aldrich	71196
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389
三氟乙酸	Sigma Aldrich	302031