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1. 带末端寡肽的聚（β-氨基酯） （OM-pBAE）聚合物的合成
- 聚合 C6-pBAE
- 将 5-氨基-1-戊醇（38 mmol；分子量 = 103.16 Da）和 1-己胺（38 mmol；分子量 = 101.19 Da）加入圆底玻璃烧瓶（100 mL）中，然后加入 1,4-丁二醇二丙烯酸酯（82 mmol；分子量 = 198.22 Da）。
- 将硅油浴预热至 90 °C，将圆底烧瓶置于油浴中，并借助磁力搅拌子搅拌混合物过夜（约 18 小时）。然后将产物从圆底烧瓶中取出，并在 -20 °C 冰箱中冷冻。
注意： 产物呈粘稠粉末状，需借助刮刀从烧瓶中取出。必须通过 1H-NMR 验证所得聚合物的结构。核磁共振谱在 400 MHz 仪器（见 材料表）中测定，使用氘代氯仿和 D2O 作为溶剂。取约 10 mg 每种聚(β-氨基酯)，溶解于 1 mL 氘代溶剂中。
- 与多肽反应制备 OM-pBAE
- 将 25 mL 0.1 M 盐酸加入选定的多肽（例如 Cys-His-His-His 多肽）中，加入三氟乙酸（TFA，200 mg），置于预先称重的 50 mL 离心管中（该离心管需可耐受冻干），手动搅拌过夜，以获得澄清溶液。
- 在 -80 °C 下冷冻溶液 1 小时，随后冻干得到多肽盐酸盐。
注意：检查最终重量是否与理论值相符。
- 将 C6-pBAE（0.031 mmol）溶于二甲基亚砜，配制成溶液。同时将多肽盐酸盐（0.078 mmol）溶于二甲基亚砜，配制成另一溶液。
- 将两种溶液混合于螺口管中，拧紧盖子。将混合溶液置于温度控制为 25 °C 的水浴中，用磁力搅拌子搅拌 20 小时。
- 将混合物加入 7:3（v/v）乙醚/丙酮混合液中。在 4 °C 下以 25,000 x g 离心，以去除溶剂。随后，用 7:3（v/v）乙醚/丙酮洗涤沉淀物两次。然后在真空条件下干燥产物（<0.2 atm）。
- 将产物以 100 mg/mL 的浓度溶于二甲基亚砜中。所得产物命名为 C6-多肽-pBAE。必须通过 1H-NMR 验证所得聚合物的结构，以确认末端丙烯酸酯相关的烯烃信号消失。若不立即使用，可将聚合物在 -20 °C 下冷冻保存。
2. 聚合物复合物的形成
注意：所有操作均应在温控室内进行，以保持恒定的温度。
- 解冻聚合物 C6-肽-pBAE 并涡旋溶液。
- 用移液器反复吹打聚合物混合物，并在醋酸钠（NaAc）中配制 12.5 mM（V1）的溶液。然后涡旋混合物并静置 10 分钟。
- 将信使核糖核酸（mRNA）配制成 0.5 mg/mL 的溶液，并通过移液吹打混合（V2）。
注意：切勿涡旋 mRNA 溶液。
- 涡旋聚合物混合物至最终浓度，以使聚合物的二甲基亚砜（DMSO）储备液与醋酸盐缓冲液充分混匀，形成均一溶液。
注意：最终聚合物浓度取决于所选的 N/P（氮/磷酸基团）比。N/P 比取决于所使用的特定 mRNA。例如，在封装增强型绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA 时，如先前报道，采用 25:1 的比例。
- 将遗传物质溶液与 C6-肽-pBAE 溶液（浓度为 mRNA 的 25 倍）按 1:1 的比例混合（Vi = V1 + V2）。
注意：C6-肽-pBAE 装于微量离心管中，通过上下移液将 mRNA 加入并混合。一旦配制完成，聚复合物（polyplex）中核酸和 C6-肽-pBAE 的浓度均被稀释一半。
- 在 25 °C 的温控金属块中孵育 30 分钟。通过将样品加入预先装有 RNase-free 水的微量离心管中，按 1:2 的比例进行沉淀。
- 加入辅料。用移液器上下吹打，加入与 mRNA 和 pBAE 混合物体积相等的 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 4% 蔗糖溶液（体积为 Vi）。此时，样品总体被稀释了 3 倍。
3. 聚合物复合物的冻干
- 将先前的聚集体溶液立即置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻 1 小时。
- 按以下步骤进行初次干燥：（1）-60 °C、0.001 hPa 条件下 1 小时；（2）-40 °C、0.0001 hPa 条件下 1 小时；（3）-20 °C、0.0001 hPa 条件下 4 小时；（4）5 °C、0.0001 hPa 条件下 12 小时。
- 立即于 -20 °C 保存，以避免使用前重新吸水。