使用亲和层析纯化自组装蛋白质纳米颗粒

摘要

来源：Karch, C. P. 等，用于需要三聚体表位呈递疫苗的E. coli表达自组装蛋白纳米颗粒的制备 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用亲和液相色谱纯化组氨酸标签自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的方法。所获得的纯化SAPN组分适用于疫苗开发，在潜在的免疫治疗应用中具有广阔前景。

方案

1. 含六螺旋束（SHB-SAPN）蛋白的自组装蛋白纳米颗粒核心的表达 E. coli BL21(DE3)

1. 根据制造商说明（参见材料表），在2 L无菌玻璃锥形瓶中混合95 mL培养基A组分和5 mL B组分。加入氨苄青霉素，使其终浓度为100 μg/mL。
2. 用先前建立的甘油菌种接种E. coli。在30 °C、200转/分钟（rpm）振荡条件下培养48小时。
   注意：所用的E. coli BL21 (DE3) 菌种含有氨苄青霉素抗性表达载体，携带SHB-SAPN基因。尽管培养基的一般操作建议在37 °C培养24小时，但在30 °C培养48小时可获得更高的SHB-SAPN表达量。
3. 将菌液转移至两个50 mL圆锥管中。在4 °C条件下，使用固定角转子以4,000 × g离心10分钟。弃去上清液，保留沉淀以收获细胞。
   注意：细胞沉淀可立即进行后续处理，也可在-80 °C冷冻保存待用。

2. 裂解 E. coli BL21(DE3) 超声破碎法

注意：使用无热原的塑料器皿和玻璃器皿，并在250 °C下烘烤至少30分钟。三(2-羧乙基)膦（TCEP）作为还原剂，可断裂蛋白质内部及蛋白质之间的二硫键。如果目标抗原含有S-S键，则本实验方案所用缓冲液中必须添加TCEP。但对于SHB-SAPN核心而言，缓冲液中是否含有TCEP并非必需。

1. 配制不含咪唑的缓冲液（8 M 尿素，50 mM 一价磷酸钠，20 mM Tris 碱，5 mM TCEP），用 5 N 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 8.0，并使用 0.22 µm 真空瓶过滤装置过滤。
2. 用 40 mL 不含咪唑的缓冲液在一支 50 mL 圆锥管中重悬沉淀细胞（来自步骤 1.3）。在冰上使用探头超声仪对重悬细胞进行超声处理，共 5 分钟（超声 4 秒，间歇 6 秒），超声输出功率为 150 W。
3. 将细胞裂解液（40 mL）在 4 °C 条件下，以 29,000 × g 离心 25 分钟（使用固定角转子），以获得澄清的上清液。将上清液转移至一个 150 mL 无菌烧瓶中，并弃去沉淀。用不含咪唑的缓冲液将上清液稀释至 100 mL（在后续实验步骤中称为“样品”）。
   注意：此稀释步骤是为了防止在将裂解液上样到层析柱时，快速蛋白液相色谱（FPLC）系统的压力过高。

3. 使用 His 柱进行蛋白质纯化

注意：本实验方案使用FPLC仪器进行，但也可适配于重力流方法。

1. 准备以下缓冲液，并使用 0.22 µm 真空瓶过滤装置进行过滤：(i) 不含咪唑的缓冲液“缓冲液 A”（8 M 尿素，50 mM 一碱磷酸钠，20 mM Tris 碱，5 mM TCEP），pH 8.0；(ii) 500 mM 咪唑缓冲液“缓冲液 B”（8 M 尿素，50 mM 一碱磷酸钠，20 mM Tris 碱，5 mM TCEP，500 mM 咪唑），pH 8.0；以及 (iii) 异丙醇洗涤液（20 mM Tris，60% 异丙醇），pH 8.0。
   注意：每种缓冲液的 pH 值均使用 5 N NaOH 调节。
2. 平衡 His 柱。
   注意：对于实验室规模的制备，本方案使用 5 mL 预装 His 柱，但也可使用任何更大尺寸的柱子。
   1. 打开 FPLC 软件，点击 新建方法 选项。界面将立即跳转至 方法设置 菜单。在柱位下拉菜单中选择 C1 3 号端口。
   2. 在 按技术显示 的下拉菜单中选择 亲和层析。在 柱类型 下拉菜单中选择 其他，Histrap HP，5 mL。柱体积和压力框将自动设置为相应数值。
   3. 点击 方法流程 按钮。从 阶段库 弹出菜单中依次将以下按钮拖拽至箭头右侧： 平衡、上样、柱洗涤 和 洗脱，顺序必须准确。关闭 阶段库 菜单。
   4. 点击 平衡 按钮。表中列出的数值应为“初始缓冲液 B”（4%），“最终缓冲液 B”（4%），“体积（CV）”为 5。
   5. 点击 上样 框。在样品加载框中，选中 使用样品泵将样品注入柱中 的单选按钮。确保在“使用系统泵进行样品注射”框中，使用方法设置中的流速 旁边的复选框已被勾选。在屏幕右侧的体积框旁，将数值更改为 20 mL。
   6. 点击 柱洗涤 按钮。表中列出的数值应为“初始缓冲液 B”（4%），“最终缓冲液 B”（4%），“体积（CV）”为 5。在馏分收集方案旁，取消勾选 启用框。
   7. 点击 洗脱 按钮。表中列出的数值应为“初始缓冲液 B” 0%，“最终缓冲液 B” 100%，“体积（CV）”为 5。在馏分收集方案旁，点击 启用 框。取消勾选 使用方法设置中的馏分大小，并在下方填空框中将馏分大小调整为 4 mL。
   8. 点击软件顶部的 另存为 按钮。将文件命名为“平衡”。
   9. 将 5 mL 预装 His 柱连接至 FPLC 上对应的 3 号柱端口。泵 A 和泵 B 的管路，以及样品泵管路，均应置于经 0.22 µm 过滤的去离子水中。运行平衡程序。
   10. 将泵 A、泵 B 以及样品泵的管路均移入不含咪唑的缓冲液（缓冲液 A）中，并再次运行平衡程序。
3. 将样品结合至柱上并纯化蛋白。
   1. 打开 FPLC 软件，点击 新建方法 选项。界面将立即跳转至 方法设置 菜单。在 柱位 下拉菜单中选择 C1 3 号端口。在 按技术显示 下拉菜单中选择 亲和层析。在柱类型下拉菜单中选择 其他，Histrap HP，5 mL。柱体积和压力框将自动设置为相应数值。
   2. 点击 方法流程 按钮。从 阶段库 弹出菜单中依次将以下按钮拖拽至箭头右侧： 平衡、上样、柱洗涤（洗涤 1）、柱洗涤（洗涤 2）、柱洗涤（洗涤 3）和 洗脱，顺序必须准确。关闭 阶段库 菜单。
   3. 点击 平衡 按钮。表中列出的数值应为“初始缓冲液 B” 4%，“最终缓冲液 B” 4%，“体积（CV）”为 5。
   4. 点击 上样 框。在样品加载框中，选中 使用样品泵将样品注入柱中 的单选按钮。确保在“使用系统泵进行样品注射”框中，使用方法设置中的流速 旁边的复选框已被勾选。
   5. 在屏幕右侧的体积框旁，将数值更改为 100 mL。在馏分收集方案旁，点击 启用 按钮。取消勾选 使用方法设置中的馏分大小 框，然后将馏分大小更改为 4 mL。
   6. 点击第一个柱洗涤按钮（洗涤 1）。表中列出的数值应为“初始缓冲液 B” 4%，“最终缓冲液 B” 4%，“体积（CV）”为 10。在馏分收集方案旁，点击 启用 框。取消勾选 使用方法设置中的馏分大小，然后将馏分大小更改为 4 mL。
   7. 点击第二个柱洗涤按钮（洗涤 2）。表中列出的数值应为“初始缓冲液 B” 0%，“最终缓冲液 B” 0%，“体积（CV）”为 5。在馏分收集方案旁，点击 启用 框。取消勾选 使用方法设置中的馏分大小，然后将馏分大小更改为 4 mL。
   8. 点击第三个柱洗涤按钮（洗涤 3）。表中列出的数值应为“初始缓冲液 B” 0%，“最终缓冲液 B” 0%，“体积（CV）”为 5。在馏分收集方案旁，点击 启用。取消勾选 使用方法设置中的馏分大小 框，然后将馏分大小更改为 4 mL。
   9. 点击 洗脱 按钮。在右侧表格中点击所列信息，在弹出菜单中点击 删除步骤。将等度梯度按钮拖拽至表格中两次，使表格中出现两个条目。
   10. 第一个条目的数值应为“初始缓冲液 B” 30%，“最终缓冲液 B” 30%，“体积（CV）”为 10。第二个条目的数值应为“初始缓冲液 B” 100%，“最终缓冲液 B” 100%，“体积（CV）”为 10。在馏分收集方案旁，点击 启用 按钮。勾选 使用方法设置中的馏分大小 旁边的复选框。
   11. 点击软件顶部的 保存 按钮。将文件命名为“纯化”。FPLC 的泵 A 管路应置于不含咪唑的洗涤缓冲液中，泵 B 管路应置于 500 mM 咪唑缓冲液中。样品泵管路应置于 100 mL 样品中。
   12. 运行“纯化”程序，并等待需要 60% 异丙醇的步骤（洗涤 2）到来。暂停程序；将泵 A 管路从不含咪唑的洗涤缓冲液移至 60% 异丙醇洗涤液中。重新启动程序。
   13. 异丙醇步骤完成后，再次暂停程序，并将泵 A 管路移回不含咪唑的洗涤缓冲液中。重新启动纯化程序（后续步骤为自动运行）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-丙醇	Fisher	BP26181	4 L
氨苄青霉素	Fisher	BP1760-25	25 g
Corning 一次性真空过滤/储存系统	Fisher	09-761-108	多种规格
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP 预装柱	GE HealthCare	45-000-325	5 支装
甘油	Fisher	BP229-4	4 L
咪唑	Fisher	O3196-500	500 g
Magic Media E. coli 表达培养基	ThermoFisher	K6803	1 L
MilliporeSigma Millex 无菌注射器 0.22 mm 滤器	Millipore	SLGV033RB	250 支装
One Shot BL21 Star (DE3) 化学感受态 E. coli	ThermoFisher	C601003	20 瓶
磷酸二氢钠	Fisher	BP329-500	500 g
Tris 碱	Fisher	BP152-1	1 kg
尿素	Fisher	BP169-500	2.5 kg
设备
Fiberlite F14-14 x 50cy 固定角转子	ThermoFisher	096-145075	转子
NGC Quest 10 层析系统	BioRad	7880001	用于蛋白质纯化的 FPLC 系统
Sonifer 450	Branson	also known as 096-145075	超声破碎仪