构建具有抗HIV工程化免疫系统的人源化小鼠模型

摘要

来源：Zhen, A., 等. 人源化小鼠模型中基于干细胞的抗 HIV 感染人工免疫. J. Vis. Exp. (2016).

该视频展示了一种利用基于干细胞的工程化免疫系统构建人源化小鼠模型的技术，以抵抗人类免疫缺陷病毒（HIV）。将人类胎儿胸腺组织和经过基因工程改造的造血干细胞（HSCs）植入重度免疫缺陷小鼠的肾包膜下。这些表达针对HIV的嵌合抗原受体（CARs）的HSCs被混合于一种胶状蛋白质混合物中，以促进其与胸腺组织的共定位。术后，HSCs分化为多种人类免疫细胞，从而形成功能性人类免疫系统对抗HIV的人源化小鼠模型。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。所有涉及动物模型的程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 构建表达CD4嵌合抗原受体的人源化小鼠

1. 处理胎儿胸腺并从胎儿肝脏中分离CD34+造血干细胞
   1. 胸腺处理
      1. 在15 ml锥形管中用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）轻轻洗涤胸腺。重复洗涤步骤3–4次。
      2. 加入7 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培养基 + 10% 胎牛血清 (FBS) + 青霉素/链霉素 (Pen/strep)，将所有成分倾倒至无菌的100 mm培养皿中。
      3. 使用手术刀将胸腺切成约1 mm的小块²将每一块胸腺组织分别放入96孔板的单个孔中。转移胸腺组织时使用弯头钝性镊子。
         1. 向所有孔中加入少量培养基（100 - 200 μl），以防止组织干燥。在显微镜下观察（胸腺具有叶状结构，应呈细胞囊袋样外观）。
            注意： 丢弃任何外观可疑的组织碎片；组织中常含有结缔组织，不应将其植入。
      4. 移除已确认的胸腺组织块，并将所有组织块放入一个T25细胞培养瓶中。加入7 ml RPMI培养基，添加10%胎牛血清以及450 μg/ml哌拉西林/他唑巴坦和两性霉素B。轻轻摇动培养瓶以混匀。于37 ºC、5% CO₂条件下培养过夜。₂.
         注意： 此步骤旨在防止组织受到细菌污染。
      5. （可选步骤）将胸腺组织冷冻以备后续使用。用含10%二甲基亚砜（DMSO）的90%人AB血清平衡组织块10分钟。以1 ºC/min的速率降温至-50 ºC，随后快速冷却至-150 ºC。解冻时，在37 ºC水浴中快速融化，并用不含DMSO的RPMI完全培养基轻柔洗涤3次。
   2. 肝脏处理
      1. 在50 ml锥形管中用PBS轻轻洗涤肝脏，重复洗涤步骤3–4次。
      2. 向50 ml锥形管中加入10 ml Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）。将所有液体倾入一个100 mm无菌培养皿中。
      3. 使用两把手术刀匀浆肝脏组织，将肝脏切成约3 mm的小块²切除并弃去所有白色结缔组织。
      4. 使用带有16号钝头针头的10 ml注射器吸取肝脏组织块及培养基，随后转移至50 ml锥形管中。
      5. 重悬培养基和组织悬液，并反复吹打5-7次，以彻底均质化组织。
      6. 准备10 ml IMDM培养基，添加以下酶：500 U/ml胶原酶、2,400 U/ml透明质酸酶和300 U/ml DNase，以及450 μg/ml哌拉西林/他唑巴坦和两性霉素B。使用0.22 µm滤器过滤培养基，然后将其加入肝组织悬液中。
      7. 将含有肝组织悬液的50 ml锥形管盖紧，并用封口膜（如Parafilm）密封，防止泄漏。在37 °C培养箱中，使用管式旋转仪旋转孵育90分钟。
      8. 将消化后的细胞悬液通过100 µm细胞滤网过滤至一个新的50 ml离心管中。
         注意： 加入 PBS 至悬液中，使总体积达到 50 ml。将悬液均分为两份，分别加入两个 50 ml 离心管中，每管含有 25 ml 细胞悬液。
      9. 在每根试管中，缓慢轻柔地将10 ml密度梯度离心液加入细胞下方例如， Ficoll）。以1,200 × g离心20分钟，不启用刹车。 注意：本方案中提及的所有离心操作均在室温（25 ºC）下进行。
      10. 小心地移除界面（即从每管中收集界面层（如白膜层），转移至两个独立的50 ml离心管中。用PBS将每管的体积补至50 ml。在300 × g下离心7–10分钟。小心吸除上清液。
      11. 合并两个沉淀。用含有2% FBS的50 ml PBS再洗涤三次，每次以300 × g离心7–10分钟，并小心吸除上清液。
      12. 将沉淀重悬于50 ml RPMI培养基（含10% FBS）中。在进行细胞分选前，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
      13. 根据制造商说明书，立即使用 CD34 分选试剂盒（例如，CD34 微磁珠）对 CD34+ 细胞进行分选。
          注意： 或者，细胞可在 RPMI 培养基 + 10% FBS 中以每毫升100万个细胞的密度培养过夜。
      14. 同时保存 CD34+ 和 CD34- 组分。
          注意： 在此步骤中，可使用 Bambanker 冻存液或其他冻存液对 CD34+ 和 CD34- 细胞进行冷冻。每管冻存 1 ml，细胞密度为 4–6 × 10⁶ 每管 CD34+ 细胞，分装 1 ml，冻存于 40 - 60 x 10⁶ 每管 CD34- 细胞数
2. CD34+ 细胞的转导
   1. 计算6孔组织培养板所需的转导孔数。每个孔最多可用于转导8 x 10⁵个细胞。⁶ 细胞。每只骨髓/肝脏/胸腺（BLT）小鼠接种0.5 × 10⁶ CD34+ 细胞将与 CD34- 细胞及胸腺一同植入肾包膜下，数量为 0.5 x 10⁶ CD34+ 细胞将通过静脉注射。所用 CD34+ 细胞的数量根据小鼠数量确定（每只小鼠 100 万个细胞）。
   2. 将所需数量的未经组织培养处理的6孔板孔中，每孔加入1.25 ml重组人纤维连接蛋白溶液（例如，Retronectin）（20 µg/ml PBS溶液）加入每孔中。用盖子盖好培养板，在洁净的生物安全柜中室温孵育2小时。
   3. 吸出各孔中的纤连蛋白溶液，每孔加入1.25 ml 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含4% FBS的PBS）以进行封闭。将培养板在室温（25 ºC）下静置30分钟。
   4. 吸去FACS缓冲液，用PBS洗涤孔板一次。
   5. 将 PBS 保留在包被的孔中，直至准备使用该板。如不立即使用，需在 4 ºC 下过夜储存。
   6. 将CD34+细胞接种于感染培养基（含2%人血清白蛋白的Yssel无血清T细胞培养基）中，置于纤维连接蛋白溶液包被的孔板内（约2 x 10⁶ 细胞/毫升），37 ºC 下孵育 1 小时。
   7. 使用移液器将慢病毒载体加入孔中，感染复数（MOI）为 2 - 10。轻轻混匀，于 37 ºC 培养过夜。
      注意： 应预先确定所用慢病毒载体的滴度。
   8. 第二天用细胞刮棒轻轻刮取孔底的细胞，收集细胞并用血细胞计数板进行计数。
   9. 为准备用于移植的细胞，将 0.5 x 10⁶ 转导CD34+细胞，转导量为4.5 x 10⁶ 每只小鼠的 CD34- 细胞分装至无菌 1.5 ml 螺口管中。在 300 × g 条件下离心以形成细胞沉淀，吸除上清液。再次在 300 × g 条件下离心，使用 P10 移液器小心吸除残留的上清液，操作时需格外谨慎。在整个实验过程中，将干燥的细胞沉淀置于冰上保存。 注意： 为确保细胞具有活性，应使用离心后的细胞，并在2-3小时内完成手术。
   10. 为准备用于注射的细胞，将 0.5 x 10⁶ 细胞离心⁶ 每只小鼠的转导CD34+细胞离心后弃去上清液。每只小鼠用100 µl RPMI培养基重悬细胞，置于冰上保存。
   11. 为检测转导效率，取约 1 x 10⁵ 非转导和转导的CD34+细胞，每种条件及培养均在96孔板中进行，加入200 µl细胞因子培养基（RPMI培养基含10% FBS，添加100 ng/ml人IL-3、IL-6、SCF），于37 ºC培养5–7天。
       注意： 此步骤中使用的细胞不用于手术，而是用于确认转导成功，并验证载体对干细胞的存活与自我更新无毒性。可通过检测载体的基因表达来检查转导效率例如，GFP&CD4）并通过流式细胞术进行分析。
3. 利用组织移植构建基因工程小鼠​
   1. 手术当天之前，对NOD小鼠进行全身照射。Cg-Prkdcscid Il2rg使用剂量为2.7 Gy（270 Rad）的铯-137辐照器对tm1Wjl/SzJ（NSG）免疫缺陷小鼠进行辐照。
      注意： NSG 小鼠具有严重的免疫缺陷，因此其饲养和维护必须符合最高健康标准，并由经过高度培训的人员进行操作。
   2. 将胸腺组织碎片和培养基从烧瓶倒入一个60 mm培养皿中。向另一个60 mm培养皿中加入PBS，用于清洗套管针并保持肾脏湿润。
   3. 将正向置换移液器吸头放入盛有冰的开放1.5 ml无菌螺口管中进行预冷。与干燥的细胞沉淀及凝胶状蛋白质混合物（如Matrigel）一同保持在冰上。
      注意： 在将凝胶状蛋白质混合物装入植入针之前，必须使其以及所有会接触它的试管或枪头保持低温。
   4. 麻醉小鼠：分别称量小鼠体重并记录；通过耳缘打孔标记编号。按每克体重15 µl的剂量，经腹腔注射 Ketamine（2.6 mg/ml 生理盐水溶液）/Xylazine（100 mg/ml 生理盐水溶液）。将小鼠放回笼中，等待其完全麻醉。
      注意： 通过轻捏小鼠足部检查其麻醉程度。若小鼠出现反射性退缩反应，追加原剂量25-50%的氯胺酮/赛拉嗪以加深麻醉。待小鼠不再出现反射性退缩反应后，再进行手术操作。
   5. 使用Oster剃毛器，将每只小鼠从背部中线至腹部之间的左侧区域，由臀部至肩部进行剃毛。在小鼠肩部或腹股沟三角区（腿窝）皮下注射0.3 ml稀释的卡洛芬（6 mg/kg）。用棉签在每只眼睛上滴一滴人工泪液，然后将小鼠侧卧放回笼中。
      注意： 每次手术准备仅限一个鼠盒（约4至5只小鼠）。
   6. 用 PBS 冲洗 16 号癌细胞植入针（套管针）的套管。用一对钝头弯镊将 60 mm 培养皿中的一块胸腺组织放入套管开口处，将套管针略微插入开口内，然后向后拉动套管针，将组织吸入套管中。
   7. 使用正位移移液器和预冷的吸头，将5 µl冷的凝胶状蛋白混合物加入含有干燥细胞沉淀的离心管中（植入细胞为CD34+与CD34-细胞混合物），轻轻搅拌以形成细胞悬液。切勿反复吹打。将凝胶状蛋白混合物/细胞悬液移入套管针开口处，缓慢回拉穿刺针，使针头完成装填。
      注意： 建议在操作植入针的同时，由一名助手协助加载移液器。
   8.  用聚维酮碘擦拭小鼠脱毛区域，随后用酒精棉片擦拭该区域三次。确定皮肤下方颜色最深的部位，此位置即为脾脏所在。肾脏位于脾脏背侧约5 mm处。用弯头镊子提起皮肤，沿与脾脏平行的方向用手术剪在皮肤上做一个长约15 mm的切口。接着，在下方的腹膜层做相似的切口。在雄性小鼠中，肾脏应清晰可见，仅需按压腹部即可使其突出，可用止血钳或弯头钝头镊子托住肾脏。在雌性小鼠中，卵巢常阻碍肾脏的顺利取出，此时可用止血钳夹起卵巢，小心暴露肾脏。
   9. 使用尖头镊子在肾被膜的后端夹出一个微小孔洞。
      注意： 切勿使用这些针尖镊子处理生物危害性材料。
   10. 将植入针滑入此孔并沿肾脏推进，直至套管开口完全被肾包膜覆盖。
   11. 轻轻将肾包膜下的组织推出，并将针头缓缓退出。由于胸腺组织碎片可能具有黏性，需使用弯头镊子确保胸腺碎片不随针头带出。
   12. 用镊子提起腹膜，用止血钳轻柔地将肾脏复位。使用4-0薇乔可吸收缝线在腹膜上缝合一针双结缝合线。使用两个Autoclip伤口夹闭合皮肤。
   13. 将用于注射的转导CD34+细胞混合，并吸取100 µl（0.5x10⁶）⁶ 将细胞注入胰岛素注射器中，通过眶后静脉注射或其他静脉注射途径将这些细胞注入小鼠体内。用棉签在每只眼睛上滴一滴人工泪液，并将小鼠侧放回笼中。
   14. 所有小鼠植入操作完成后，在离开前需确认动物已恢复意识且能够正常行走。
   15. 术后护理：手术后第一天，为每只小鼠皮下注射0.3 ml稀释的卡洛芬（6 mg/kg）和1.2 ml无菌生理盐水。术后第2天和第3天，为每只小鼠皮下注射1.5 ml无菌生理盐水。手术后持续观察小鼠及其切口部位10–14天。10–14天后拆除自动夹扣并称量小鼠体重。 注意： 辐射后小鼠活动迟缓，注射生理盐水可防止动物脱水。
   16. 8至10周后，通过采集小鼠外周血并进行FACS分析检测移植情况，检测标记物如CD45、CD3、CD4、CD8以及载体应表达的任何基因。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD34 微珠试剂盒	miltenyi	130-046-702	用于分选人 CD34+ 祖细胞
Bambanker	Wako	302-14681	用于细胞冻存
QIAamp 病毒 RNA 试剂盒	Qiagen	52904	用于测定血清中的病毒载量
MACSQuant 流式细胞仪	Miltenyi		用于流式分析
BD LSRFortessa™	BD biosciences		用于流式分析
透明质酸酶	Sigma	H6254-500MG	用于组织消化
脱氧核糖核酸酶 I	Worthington	LS002006	用于组织消化
胶原酶	Life technology	17104-019	用于组织消化
CFX 实时荧光定量 PCR 检测系统	Biorad		用于测定病毒载量和基因表达
小鼠，品系 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	The Jackson Laboratory	5557	用于构建人源化小鼠
青霉素-链霉素（Pen Strep）	Thermo Fisher Scientific	10378016	用于细胞培养
哌拉西林/他唑巴坦	Pfizer	Zosyn	抗真菌
两性霉素 B（Fungizone 抗真菌剂）	Thermo Fisher Scientific	15290-018	抗真菌
AUTOCLIP 伤口夹，9 mm，1000 个/盒	Becton Dickinson	427631	用于手术
无菌聚酯增强型 Aurora 外科手术服，每箱 30 件	Medline	DYNJP2707	用于手术
缝线，4-0，Vicryl	Owens and Minor	23000J304H	用于手术
酒精消毒片	Owens and Minor	3583006818	用于手术
外科手套，6 1/2 号	Owens and Minor	4075711102	用于手术
Yssel 无血清 T 细胞培养基	Gemini Bio-products	400-102	用于 CD34+ 细胞转导
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9511	用于 CD34+ 细胞转导