构建具有针对 HIV 的工程免疫的人源化小鼠模型

Abstract

来源:Zhen， A.， et al. 基于干细胞的人源化小鼠模型中针对 HIV 感染的工程免疫。J. Vis. Exp. （2016 年）。

该视频演示了一种生成人源化小鼠模型的技术，该模型具有针对人类免疫缺陷病毒 （HIV） 的基于干细胞的工程免疫力。将人胎儿胸腺组织和工程造血干细胞 （HSC） 植入严重免疫功能低下的小鼠的肾包膜中。HSC 表达针对 HIV 的嵌合抗原受体 （CAR），混合在凝胶状蛋白质混合物中，促进它们与胸腺组织的共定位。手术后，HSC 分化成各种人类免疫细胞，从而开发出具有针对 HIV 的功能性人类免疫系统的人源化小鼠模型。

Protocol

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 用 CD4 嵌合抗原受体改造的人源化小鼠的构建

1. 处理胎儿胸腺并从胎儿肝脏中分离 CD34+ HSC
   1. 胸腺加工
      1. 在 15 ml 锥形管中，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.4） 轻轻洗涤胸腺。重复洗涤步骤 3 - 4 次。
      2. 加入 7 ml 罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基 + 10% 胎牛血清 （FBS） + 青霉素/链霉素 （Pen/strep）。将所有物品倒入无菌的 100 mm 培养皿中。
      3. 用手术刀将胸腺切成约 1 毫米² 的小块。将每块胸腺放入 96 孔板的单个孔中。将胸腺碎片转移到 96 孔板时使用弯曲的钝镊子。
         1. 向所有孔中加入少量培养基 （100 - 200 μl），使组织不会干燥。在显微镜下观察（胸腺有裂片，应该看起来像一袋袋细胞）。
            注意:丢弃任何看起来有问题的碎片;通常有结缔组织，不应植入。
      4. 取出确认的胸腺碎片，并将其全部放入 T25 细胞培养瓶中。加入 7 ml 补充有 10% FBS 和 450 μg/ml 哌拉西林/他唑巴坦和两性霉素 B 的 RPMI 培养基。轻轻摇动烧瓶混合。将培养瓶在 37 ºC/5% CO₂.
         下培养过夜 注意: 此步骤是防止组织受到细菌污染所必需的。
      5. （可选步骤）冷冻胸腺以备将来使用。将 90% 人 AB 血清中含有 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 的块状物平衡 10 分钟。以 1 ºC/min 的速度冷冻至 -50 ºC，然后快速冷却至 -150 ºC。准备解冻时，在 37 ºC 水浴中快速解冻，并在不含 DMSO 的 RPMI 完全培养基中轻轻洗涤 3 次。
   2. 肝脏加工
      1. 在 50 ml 锥形管中用 PBS 轻轻洗涤肝脏。重复洗涤步骤 3 - 4 次。
      2. 将 10 ml Iscove 改良的 Dulbecco's 培养基 （IMDM） 添加到 50 ml 锥形管中。将所有物品倒入 100 mm 无菌培养皿中。
      3. 使用两把手术刀匀浆肝组织。将肝脏切成约 3 毫米² 的小块。切掉并丢弃任何白色结缔组织。
      4. 使用装有 10 号钝针的 16 ml 注射器吸取肝脏碎片和培养基。然后，转移到 50 ml 锥形管中。
      5. 重悬培养基和组织悬液，再排出 5-7 次以使组织完全匀浆。
      6. 准备 10 ml 补充有酶的 IMDM 培养基:500 U/ml 胶原酶、2,400 U/ml 透明质酸酶和 300 U/ml DNase 以及 450 μg/ml 哌拉西林/他唑巴坦和两性霉素 B。通过 0.22 μm 过滤器过滤培养基，然后将培养基添加到肝脏悬浮液中。
      7. 盖上含有肝脏悬液的 50 ml 锥形管，并用自密封膜（如 Parafilm）密封以防止泄漏。在培养箱中的试管旋转器中于 37 ºC 旋转 90 分钟。
      8. 通过 100 μm 细胞过滤器将消化的细胞悬液过滤到新鲜的 50 ml 管中。
         注意:向悬浮液中加入 PBS 以将总体积增加到 50 ml。将其分成两个 50 ml 管，每个管含有 25 ml 细胞悬液。
      9. 用 10 ml 密度离心培养基（例如 Ficoll）缓慢而轻柔地将每个试管中的细胞覆盖在下。以 1,200 x g 旋转 20 分钟，无需制动。注意:本方案中提到的所有离心均在室温 （25 ºC） 下进行。
      10. 小心地从每根试管中取出接口（即血沉棕黄层），并转移到两个单独的 50 ml 试管中。用 PBS 使每管接口的体积达到 50 ml。以 300 x g 离心 7 - 10 分钟。小心吸出上清液。
      11. 将两个颗粒混合。用含有 2% FBS 的 50 ml PBS 再洗涤 3 次。以 300 x g 离心每次 7 - 10 分钟，同时小心吸出上清液。
      将
      12. 沉淀重悬于 50 ml RPMI 培养基 + 10% FBS 中。在进行细胞分选之前，使用血细胞计数器对细胞进行计数。
      13. 根据制造商的方案，立即使用 CD34 分选试剂盒（例如 CD34 微珠）对 CD34 + 细胞进行分选><。 注意:或者，细胞可以在 RPMI 培养基 + 10% FBS 中以 100 万/mL 的浓度培养过夜。
      14. 保存 CD34 + 和 CD34 - 级分。< br /> 注意:在此步骤中，可以使用 Bambanker 冷冻培养基或其他冷冻培养基冷冻 CD34 + 和 CD34 细胞。每管冷冻 1 ml 4 - 6 x 10⁶ 个 CD34+ 细胞，每管冷冻 1 ml 40 - 60 x 10⁶ 个 CD34 细胞。
2. CD34+ 细胞的转导
   1. 计算 6 孔组织培养板所需的转导孔数。一个孔可用于转导多达 8 x 10^{个 6} 个细胞。对于每只骨髓/肝脏/胸腺 （BLT） 小鼠，将 0.5 x 10⁶ 个 CD34+ 细胞与 CD34- 细胞和胸腺一起植入肾包膜下方，并静脉注射 0.5 x 10⁶ 个 CD34+ 细胞。要使用的 CD34 + 细胞数量由小鼠数量决定（每只小鼠 100 万个细胞）。
   2. 用 1.25 ml 重组人纤连蛋白溶液（例如，Retronectin）（20 μg/ml 在 PBS 中）包被所需数量的未组织培养处理的 6 孔板孔到每个孔中。盖上板，在干净的生物安全柜中室温静置 2 小时。
   3. 从孔中吸出纤连蛋白溶液，并向每个孔中加入 1.25 ml 荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液（含 4% FBS 的 PBS）以进行封闭。让板在室温 （25 ºC） 下静置 30 分钟。
   4. 吸出 FACS 缓冲液并用 PBS 洗涤孔一次。
   5. 将 PBS 保存在包被的孔中，直到板准备好使用。如果不立即使用，请将板在 4 ºC 下储存过夜。
   6. 将 CD34+ 细胞接种在感染培养基（Yssel 无血清 T 细胞培养基中的 2% 人血清白蛋白）中，置于纤连蛋白溶液包被的孔（~2 x 10⁶ 个细胞/ml）中，并在 37 ºC 下孵育 1 小时。
   7. 使用移液器将感染复数 （MOI） 在 2 - 10 之间的慢病毒载体添加到孔中。轻轻混合并在 37 ºC 下孵育过夜><。 注意: 应事先确定所用慢病毒载体的滴度。
   8. 第二天用细胞刮刀轻轻刮擦孔底部，收获细胞。收集细胞并用血细胞计数器计数。
   9. 为了准备用于植入物的细胞，将 0.5 x 10⁶ 个转导的 CD34 + 细胞与每只小鼠 4.5 x 10⁶ 个 CD34 细胞混合，分装到无菌的 1.5 ml 螺旋盖管中。将细胞以 300 x g 的速度旋转至沉淀中，并吸出上清液。再次以 300 x g 的速度旋转它们，使用 P10 移液器吸出任何剩余的上清液，然后非常小心地吸出。在整个研究过程中，将干燥的颗粒放在冰上。注意:为确保细胞存活，请使用沉淀的细胞并在 2-3 小时内进行手术。
   10. 为了制备用于注射的细胞，每只小鼠离心 0.5 x 10⁶ 个转导的 CD34 + 细胞，以沉淀并吸出上清液。每只小鼠将细胞重悬于每只小鼠 100 μl RPMI 培养基中并保持在冰上。
   11. 为了检查转导效率，将来自每种条件的 ~1 x 10⁵ 个未转导和转导的 CD34+ 细胞分装，并在 200 μl 细胞因子培养基（含 10% FBS 的 RPMI 培养基，补充有 100 ng/ml 人 IL-3、IL-6、SCF）中在 96 孔板中在 37 ºC 下培养 5 - 7 天><。 注意: 此步骤中使用的细胞不用于手术，而是用于确保转导成功，并且载体对干细胞存活和更新无毒。可以通过寻找载体的基因表达（例如 GFP&CD4）来检查转导效率，并通过流式细胞术进行分析。
3. 构建基因工程小鼠的组织移植
   1. 在手术前的同一天，进行 NOD 的全身照射。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ （NSG） 免疫功能低下小鼠，使用铯-137 辐照器和 2.7 Gy （270Rad）.
      注意:NSG 小鼠免疫功能严重低下。因此，他们的住房和维护必须符合最高的健康标准，并由训练有素的工作人员处理。
   2. 将培养瓶中的胸腺块和培养基倒入 60 mm 培养皿中。将 PBS 倒入另一个 60 毫米的培养皿中，用于清洁套管针并保持肾脏湿润。
   3. 将外置活塞式移液器吸头置于冰上的 1.5 ml 开放无菌螺旋盖管中，冷却它们。与干燥的细胞沉淀和凝胶状蛋白质混合物（如 Matrigel.
      一起保存在冰上 注意:在植入针加载之前，保持凝胶状蛋白质混合物和任何会接触它的管子或尖端保持低温非常重要。
   麻醉
   4. 小鼠:单独称量小鼠并记录体重;用耳朵打老鼠给它们编号。每克体重用 15 μl 氯胺酮（2.6 mg/ml 盐水溶液）/甲苯噻嗪（100 mg/ml 生理盐水）腹膜内注射它们）。将小鼠放回笼子里，等待它们完全麻醉。
      注意: 通过挤压爪子检查鼠标的麻醉水平。如果小鼠反射性地退缩，则施用原始量的 25-50% 的氯胺酮/甲苯噻嗪以进一步麻醉小鼠。等到它没有反射性地退缩后再进行手术。
   5. 使用 Oster 剪刀（剃须刀），从臀部到肩膀，从背部中心和腹部之间剃掉每只鼠标的左侧。皮下注射 0.3 ml 稀释的卡洛芬 （6 mg/kg） 到动物的肩部或腹股沟三角（腿坑）中。用棉签将一小滴人工泪液滴在每只眼睛上，然后将鼠标侧放回笼子里。
      注意: 一次将手术准备限制在一个笼子（大约 4 - 5 只小鼠）上。
   6. 用 PBS 冲洗 16 号癌症植入物针 （套管针） 的套管。使用一对钝弯曲的镊子，将一块胸腺从 60 毫米培养皿中放入套管的开口中，套管针就在开口内，然后拉回套管针以将组织吸入套管。
   7. 使用外置活塞式移液器和冷冻尖端将 5 μl 冷的凝胶状蛋白质混合物放入装有干燥细胞沉淀（用于植入细胞的 CD34 + 和 CD34 - 混合物）的试管中，并轻轻搅拌以产生细胞悬液。请勿上下移液。将凝胶状蛋白质混合物/细胞悬液移液到套管的开口中，然后慢慢拉回套管针以加载针头。
      注意:建议让助手在作植入针时加载移液器。
   8. 用聚维酮碘擦拭鼠标的剃光区域，然后用酒精湿巾擦拭该区域 3 次。确定皮肤下最黑的地方。这表明脾脏的位置。肾脏位于脾脏背侧约 5 毫米。用弯曲的镊子提起皮肤，并用手术剪刀在平行于脾脏的皮肤上做一个 15 毫米长的切口。然后，在下面的腹膜层中做一个类似的切口。在男性中，肾脏应该很容易看到，并且只需按压腹部即可挤出。您可以使用止血钳或弯曲的钝镊子支撑肾脏。在女性中，卵巢往往会阻止肾脏轻松提取。使用止血钳，取出卵巢并小心地露出肾脏。
   9. 用针尖镊子在肾囊的后端挖一个小孔。
      注意:请勿使用这些针尖镊子处理生物危害材料。
   10. 将植入针滑入该孔中并沿着肾脏滑入，直到套管的开口完全被肾包膜覆盖。
   11. 轻轻挤出肾囊下的组织，然后将针头拉出。胸腺片可能很粘，因此请使用弯曲的镊子确保胸腺片不会随针头脱落。
   12. 用镊子提起腹膜，轻轻使用止血钳将肾脏推回原位。使用 4-0 vicryl 可吸收缝合线在腹膜中打一针双结。使用两个 Autoclips 缠绕剪辑来闭合皮肤。
   13. 将转导的 CD34 + 细胞混合，放在一边注射，并将 100 μl（0.5x10⁶ 个细胞）摄取到胰岛素注射器中。通过眶后静脉注射或其他静脉注射途径将这些细胞注射到小鼠体内。使用棉签，将一小滴人工泪液滴在每只眼睛上，然后将鼠标侧放到笼子里。
   14. 植入所有小鼠后，确认动物正在恢复意识并正常行走，然后再离开它们。
   15. 术后护理:手术后第二天皮下注射 0.3 ml 稀释的卡洛芬 （6 mg/kg） 和 1.2 ml 无菌盐水到每只小鼠体内。手术后 2 天和 3 天，皮下注射 1.5 ml 无菌盐水到每只小鼠体内。手术后 10-14 天监测小鼠和切口。取下 Autoclips 并在 10-14 天后称量小鼠。注意: 小鼠在放疗后反应迟钝，注射生理盐水可防止动物脱水。
   16. 8 - 10 周后，通过给小鼠放血并对外周血进行 FACS 分析来检查植入，对 CD45、CD3、CD4、CD8 等标志物以及载体应表达的任何基因进行染色。

Materials