从骨髓干细胞生成质膜囊泡

摘要

来源:Xu， L. et al.， 从骨髓间充质干细胞制备质膜囊泡，用于潜在的细胞质替代疗法。J. Vis. Exp. （2017 年）

该视频演示了一种通过快速通过膜过滤器从骨髓干细胞生成质膜囊泡的方法。这些 PMV 显示出细胞质替代疗法的潜力。

方案

1. 装置的组装

1. 为确保无菌，请在使用前打开组织培养罩的紫外线 （UV） 灯 30 分钟。
2. 拧下一次性 25 mm 过滤器装置，将装置的盖子和底部浸入装满 75% 乙醇的 200 mL 玻璃杯中 30 分钟。该装置由医用级聚丙烯制成。
3. 用镊子拿起装置的盖子和底部，用手甩掉剩余的乙醇，让部件在引擎盖中风干 10 分钟。
4. 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 润湿 19 mm 聚碳酸酯膜，然后小心地将其放在装置底部的支撑基质顶部。聚合物薄膜具有光滑、平坦的表面和径迹蚀刻的 3 μm 孔。
5. 将盖子紧紧拧在底部，重新组装设备。确保膜没有从中心脱落。
6. 取下 1 mL 胰岛素注射器的针头并抽取 1 mL PBS。将注射器连接到过滤器装置上，然后将 PBS 推入装置以润湿组件并检查是否有任何泄漏。

2. 质膜囊泡 （PMV） 的产生

1. 如 Nemeth 等人报道的那样，在含有 15% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 培养基中建立骨髓间充质干细胞 （BMSC） 培养物。在 37 °C 下，在含有 5% CO₂ 的加湿培养箱中的 6 孔板中培养细胞。
2. 要增殖细胞，请去除培养基并用 0.5 mL 无钙 PBS 冲洗孔。
3. 加入 0.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（胰蛋白酶-EDTA），并将细胞在 37 °C 下孵育 3 分钟。将板贴在手掌上轻敲几次，以促进细胞分离。加入 1 mL 培养基终止消化。
4. 将细胞收集在 15 mL 锥形管中，并在台式离心机中以 200 x g 旋转 2 分钟。将细胞重悬于 4 mL 培养基中，并将细胞分装到 6 孔板的两个孔中。
   注意:细胞通常在 24 小时左右达到汇合。
5. 为了生成 PMV，通过胰蛋白酶消化从 6 孔板的一个孔（约 5 x 10⁵ 个细胞）中收获细胞，并将细胞单分散在 0.5 mL 培养基中。
6. 将细胞装入胰岛素注射器中，将其连接到过滤器装置上，然后快速推动柱塞以将细胞挤压通过过滤器。丢弃挤出的培养基，因为里面应该只有几个 PMV。
7. 将额外的 0.5 mL 培养基装入注射器中，并快速将其推入过滤器。收集第二次挤出的培养基，其中包含各种大小的 PMV。
8. 将 150 μL 收集的培养基装入 35 mm 玻璃底培养皿中，让 PMV 沉降到底部约 10 分钟。在配备 CCD 相机的倒置相差显微镜下使用 20 倍物镜检查 PMV。

材料