从骨髓干细胞制备质膜囊泡

摘要

来源：Xu, L. 等，骨髓间充质干细胞质膜囊泡的制备用于潜在的细胞质置换治疗 ，《视觉化实验杂志》（2017）

本视频展示了一种通过将骨髓干细胞快速穿过膜滤器来制备质膜囊泡的方法。这些质膜囊泡在细胞质置换治疗中具有潜在应用价值。

方案

1. 仪器装置的组装

1. 为确保无菌，使用组织培养罩前，先打开其紫外线（UV）灯照射30分钟。
2. 拧开一次性25 mm滤器单元，将单元的帽盖和底座浸入装有75%乙醇的200 mL玻璃杯中，浸泡30分钟。该单元由医用级聚丙烯制成。
3. 用镊子夹取单元的帽盖和底座，手动甩去残留乙醇，然后在超净台内静置晾干10分钟。
4. 将一张19 mm聚碳酸酯膜用磷酸盐缓冲液（PBS）润湿，并小心放置于滤器底座支撑基质的上方。该聚合物膜表面光滑平整，带有核孔径为3 µm的微孔。
5. 将帽盖与底座拧紧，重新组装滤器单元。确保膜未从中心位置移位。
6. 取下1 mL胰岛素注射器的针头，吸取1 mL PBS。将注射器连接至滤器单元，推动PBS通过滤器，以润湿组件并检测是否存在泄漏。

2. 质膜囊泡（PMVs）的制备

1. 按照Nemeth et al.报道的方法，将骨髓间充质干细胞（BMSC）接种于含15%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，在37 °C、含5% CO₂ 的湿润培养箱中培养。
2. 传代细胞时，吸除培养基，并用0.5 mL无钙PBS清洗孔板。
3. 加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA），在37 °C孵育3分钟。轻敲培养板数次以促进细胞脱落。加入1 mL培养基终止消化反应。
4. 将细胞收集至15 mL锥形离心管中，在台式离心机中以200 × g离心2分钟。用4 mL培养基重悬细胞，并将细胞分种至6孔板中的两个孔内。
   注意：细胞通常在约24小时后达到汇合状态。
5. 为制备微囊泡（PMVs），通过胰酶消化法收集6孔板中一个孔的细胞（约5 × 10⁵ 个细胞），并将其重悬于0.5 mL培养基中，制成单细胞悬液。
6. 将细胞悬液吸入胰岛素注射器，连接滤器装置，快速推动活塞使细胞通过滤膜。弃去挤出的液体，因其内含PMVs极少。
7. 向注射器中再加入0.5 mL培养基，迅速推过滤膜。收集第二次挤出的液体，其中含有不同大小的PMVs。
8. 取150 µL收集液加入35 mm玻璃底培养皿中，静置约10分钟使PMVs沉降至底部。使用配备CCD相机的倒置相差显微镜，以20倍物镜观察PMVs。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IsoporeTM 膜	Millipore	TSTP04700	3 mm 孔径
一次性滤器装置	Xinya，中国上海	25 mm	医用级聚丙烯
胰岛素注射器	BD	328446	1 ml