生成抗血管生成的肿瘤相关中性粒细胞

摘要

来源：Pylaeva, E.，等。将经处理的肿瘤相关中性粒细胞转移至荷瘤小鼠以研究其体内促血管生成潜能。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种生成抗血管生成性肿瘤相关性中性粒细胞（TANs）的实验方法。通过获取含有促血管生成性TANs的小鼠黑色素瘤组织，采用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离单细胞，并使用烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂处理，以降低其促进血管生成的能力。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

注意： 该实验方案的整体流程如图1所示。

1. B16F10 黑色素瘤细胞系的制备

1. 使用完全伊格尔改良杜尔贝科培养基（IMDMc：IMDM + 10% 胎牛血清（FBS）+ 1% 青霉素-链霉素），培养支原体阴性细胞至90%汇合的单层（约每T75培养瓶10 × 10⁶个细胞）。
2. 移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。加入6 mL含有蛋白水解酶和胶原酶的细胞解离液（见材料表），在37 °C孵育2分钟。
3. 轻轻敲击培养瓶，使残留的贴壁细胞脱落。将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在300 × g、20 °C条件下离心7分钟。
4. 弃去上清液，将沉淀用1 mL PBS充分重悬。再加入14 mL PBS，离心（300 × g、20 °C，7分钟）。
5. 弃去上清液，将沉淀用1 mL PBS重悬。
6. 计数细胞，并将其重悬于PBS中，调整浓度至3 × 10⁶/mL（用于步骤2）或6 × 10⁶/mL（用于步骤6），用于注射。细胞置于冰上保存，时间不超过30分钟。

2. 小鼠异基因肿瘤模型

1. 使用8至12周龄的雌性Ifnar1-/-小鼠10只，饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。
   注意：在皮下肿瘤生长模型中，优先选用雌性小鼠，因为雄性小鼠更具攻击性，容易抓伤肿瘤部位，从而影响肿瘤生长。
2. 使用电动剃毛器剃除小鼠侧 flank 部位的毛发，并用浸有70%乙醇的纱布对皮肤进行消毒。
3. 将制备好的B16F10黑色素瘤细胞以3 × 10⁶/mL PBS的浓度（见步骤1）吸入1 mL注射器中，使用0.4 × 19 mm针头，皮下注射100 μL细胞悬液。
   1. 每次注射前需充分混匀细胞悬液。应使用直径不小于0.4 mm的针头，以避免损伤肿瘤细胞。
4. 每笼最多饲养5只小鼠，使用游标卡尺监测肿瘤大小（长、宽和深度），持续14天。
   注意：根据动物实验管理规定，肿瘤直径不得超过15 mm，若肿瘤过大或出现坏死、溃破情况，应提前处死小鼠。
5. 第14天时，在CO₂麻醉箱中处死小鼠。
6. 用70%乙醇对皮肤进行消毒，在无菌培养皿中使用剪刀和镊子分离肿瘤组织。将肿瘤组织置于50 mL离心管中，加入完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEMc：DMEM + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素），并置于冰上保存。

3. 肿瘤相关中性粒细胞（TAN）的分离

1. 将肿瘤放入无菌的6孔板中，每孔放置5个肿瘤。用无菌剪刀将肿瘤切成2-3 mm大小的组织块。
   1. 每个肿瘤加入1 mL dispase/collagenase D/DNase I溶液（DMEMc中含0.2 mg/0.2 mg/100 mg），进行消化。在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育，并每隔15分钟用10 mL无针头注射器混匀一次，共混匀3次。
2. 为去除未消化的纤维组织，将细胞通过100 µm滤网过滤至15 mL离心管中（每孔使用一个滤网，每管收集一孔的滤过液）。加入PBS至15 mL，于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。
3. 每管加入1 mL红细胞裂解缓冲液（含150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 mM EDTA，pH 7.3，20 °C）裂解红细胞。充分混匀后，将所有离心管中的溶液合并至同一管中。2分钟后加入11 mL冰浴预冷（4 °C）的DMEMc终止反应。
4. 于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。用15 mL预冷的PBS重悬沉淀。再次于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。
5. 用1 mL PBS重悬细胞沉淀。加入3 μL Fc阻断抗体（CD16/CD32，储存浓度0.5 mg/mL），冰上孵育15分钟。
6. 加入抗体：10 μL Ly6G-藻红蛋白（Ly6G-PE，储存浓度0.2 mg/mL）和10 μL CD11b-别藻蓝蛋白（CD11b-APC，储存浓度0.2 mg/mL）。再加入20 μL 6-二脒基-2-苯基吲哚活力染料（DAPI，储存浓度5 mg/mL），避光冰上孵育30分钟。
   注意：也可使用其他活力染料与荧光标记抗体的组合。
7. 加入PBS至15 mL，于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。
8. 将沉淀用DMEMc重悬至浓度约为10 × 10⁶/mL，并置于冰上保存。
9. 使用荧光激活细胞分选仪分选CD11b⁺ Ly6G^hi的活细胞（DAPI阴性）中性粒细胞（分选门控策略见图2）。
   注意：保持细胞悬液管及收集分选细胞所用的DMEMc管置于4 °C。推荐使用以下最佳分选参数：70 μm喷嘴，最大阈值速率为22,000事件/秒，流速为1-3。
10. 使用流式细胞仪检测分选后中性粒细胞的纯度，建议纯度应达到>95%。
11. 将分选后的中性粒细胞于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。用DMEMc重悬细胞至浓度为1 × 10⁶/mL。
    注意：单个14天大小的B16F10肿瘤（直径约10 mm）中预期可获得的中性粒细胞数量约为3 × 10⁴个。

4. 体外抑制中性粒细胞中NAMPT的活性

1. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制FK866（NAMPT抑制剂）储备液，终浓度为100 mM。
2. 将分选后的中性粒细胞（步骤 3.11）分配至 96 孔圆底板的 2 个孔中（1.5 x 10⁵ 中性粒细胞/孔）。向干预孔中加入 FK866（终浓度为 100 nM），向对照孔中加入等量含 DMSO 的 DMEMc。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时₂ 在湿润的培养箱中。
3. 以 460 x g 离心 g4 °C 离心 5 分钟，弃上清液。每孔加入 200 μL PBS 重悬，重复 2 次。
4. 以 460 x g 离心 g，4 °C 离心 5 分钟，弃上清。将细胞重悬于商业内皮细胞生长培养基中（添加 4 µL/mL 内皮细胞生长补充剂、0.1 ng/mL 重组人表皮生长因子、1 ng/mL 重组人碱性成纤维细胞生长因子、90 µg/mL 肝素和 1 µg/mL 氢化可的松），调整终浓度为 0.2 × 10⁶ 个细胞/mL（体积为 0.75 mL）（用于步骤 5）；或重悬于 PBS 中，调整终浓度为 0.6 × 10⁶ 个细胞/mL⁶ 细胞/毫升（在0.25毫升中）。

结果

图1. 实验方案示意图。步骤1. B16F10黑色素瘤细胞系的制备；2. 小鼠同种异体肿瘤模型的建立；3. 从肿瘤中分离肿瘤相关中性粒细胞（TANs）；4. 体外抑制TANs中的NAMPT活性；5. 通过主动脉环实验评估TANs的促血管生成特性；6. 将处理后的中性粒细胞过继转移至同种异体肿瘤模型；7. 肿瘤生长监测及组织学检查。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 离心管	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	6,25,54,502
50 ml 离心管	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	227261
用于自动移液器的 5 ml / 10 ml / 25 ml 无菌吸头	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	6006180 / 607180 / 760180
6 孔平底细胞培养板	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	8,33,920
96 孔平底细胞培养板	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	655180
96 孔U型底细胞培养板	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	65018
抗小鼠 CD11b 抗体	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	553312	克隆号 M1/70，APC 标记，0.2 mg/mL
抗小鼠 Ly6G 抗体	BioLegend, California, U.S.	127608	克隆号 1A8，PE 标记，0.2 mg/mL
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.		细胞分选仪
Caliper	Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy 细胞计数器	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50 µm / 100 µm 无菌滤器	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany	04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R 离心机	Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany	4706
胶原酶 D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	11088858001
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，双乳酸盐)	BioLegend, California, U.S.	422801	储存液：5 mg/mL
Dispase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	41966-029	完全 DMEM：DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素
DMSO (二甲基亚砜)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	DN25-100MG
DPBS	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	14190-094
内皮细胞生长培养基	PromoCell, Heidelberg, Germany	c-22010
FBS (胎牛血清)	Biochrom, Berlin, Germany	S0115
FC 阻断剂 (抗小鼠 CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	553142	克隆号 2.4G2，储存液：0.5 mg/mL
FK 866 盐酸盐	Axon Medchem, Groningen, Netherlands	Axon 1546	储存液：100 mM
山羊抗兔 IgG H&L	Abcam, Cambridge, U.K.	ab97075	Cy3 标记，储存液：0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	12440-053	完全 IMDM：IMDM + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素
Isis GT420 剃须刀	B. Braun Asculap, Suhl, Germany	90200714
Matrigel 基底膜基质	Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands	7205011
单克隆抗肌动蛋白，α-平滑肌	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	F3777	FITC 标记，无储存液浓度信息
0.4 mm × 16 mm 针头	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	302200
Neomount	Merck, Darmstadt, Germany	HX67590916
正常山羊血清	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.	005-000-121
青霉素-链霉素	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	15140-122
Pipetus 自动移液器	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany	9907200
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	P36935
兔抗小鼠层粘连蛋白 γ1 链抗体	Immundiagnostik, Bensheim, Germany	AP1001.1	无储存液浓度信息
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	A1105-01
无菌一次性手术刀片（15 号）	MedWare, Naples, U.S.	120920
1 ml 注射器	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	303172
10 ml 注射器	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	309110
T75 无菌细胞培养瓶	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	83,39,11,302