一种检测分析试验性β-葡聚糖作为脑癌细胞免疫治疗策略的方法

摘要

来源：Folgado-Dorado, C. 等，作为胶质母细胞瘤免疫治疗策略的真菌β-葡聚糖的分离与纯化。J. Vis. Exp. (2023)

本视频演示了一种 体外 利用β-葡聚糖激活小胶质细胞产生超氧阴离子自由基（一种活性氧物质）的检测方法。在脑癌细胞中，所产生的活性氧可有效抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞死亡。

方案

β-葡聚糖诱导的小胶质细胞体外刺激研究

1. 小鼠胶质母细胞瘤和小胶质细胞在8孔腔室载玻片中的细胞培养

注意：本方案专用于GL261（胶质母细胞瘤）和BV2（小胶质细胞）细胞系。然而，经过轻微修改后，这些步骤可能也可用于研究其他肿瘤和免疫细胞系。

1. 制备添加 L-谷氨酰胺、4.5 g/L D-葡萄糖且不含丙酮酸盐的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）完全培养基。加入 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素。将培养基在 37 °C 水浴中预热 15 分钟。
2. 将冻存的 BV2 和 GL261 细胞在 37 °C 水浴中解冻 2 分钟，当细胞即将完全解冻时，立即转移至超净工作台，并将细胞分别接种于两个无菌的 T25 培养瓶中（每种细胞系各一个）。
3. 将 T25 培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，直至细胞融合。
   注意：根据冻存条件和冷冻保存时间的不同，达到融合所需时间可能有所差异。这些细胞系在 T75 培养瓶中通常需要 3 至 5 天达到融合状态。
4. BV2 细胞培养至融合后，将其以 0.6 × 10⁶ 个细胞/孔的密度接种至 8 孔腔室载玻片中。将 8 孔腔室载玻片置于培养箱中继续培养 24 小时。
5. 小胶质细胞接种至 8 孔腔室载玻片后，对 GL261 细胞重复相同的实验步骤。

2. 使用β-葡聚糖激活小胶质细胞

1. 用四种不同的β-葡聚糖（P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum 和 H. erinaceus）以0.2 mg/mL的浓度处理BV2细胞，持续72小时。其中一个实验组不进行任何处理（使用正常培养基），作为对照组。
2. 72小时后，用移液器收集上清液，并将剩余液体通过0.20 μm的针头滤器过滤。随后，将上清液在-80 °C下冷冻至少24小时。

3. 用预先激活的小胶质细胞条件培养基处理GL261细胞

1. 当GL261在8孔腔室载玻片中达到80%融合度时，加入经β-葡聚糖处理的小胶质细胞培养基，终体积浓度为25%，作用72小时（每孔总体积：250 μl）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8孔培养板	Thermo Fisher, USA	171080
DMEM高糖培养基（含GlutaMAXTM）	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda（α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶）	Novozymes, Denmark
胎牛血清	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
磷酸盐缓冲液	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
二氧化碳培养箱	Eppedorf	Galaxy 170S