一种高盐处理树突状细胞及其过继性转移至小鼠的方法

摘要

来源：Van Beusecum, J. P.，等。高盐处理抗原提呈树突状细胞的分离与过继转移。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种将高盐处理的抗原呈递性树突状细胞（DCs）过继转移至小鼠体内的实验方法。将小鼠CD11c+树突状细胞（DCs）暴露于含高浓度钠的培养基中，使细胞内形成异构左旋糖醛（IsoLG）-蛋白加合物。这些加合物作为新抗原，呈递于DC细胞表面。随后通过过继细胞转移技术，将经高盐处理的细胞注射入小鼠体内。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠脾脏的分离

1. 准备1640 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基：含10%胎牛血清（FBS）、0.10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM 丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇和1%青霉素/链霉素。
2. 通过吸入CO₂处死10–12周龄的C57bl/6雄性小鼠。用70%乙醇喷洒小鼠胸部及体侧。在左侧小心切开皮肤和腹膜腔，暴露脾脏。
3. 使用小型镊子谨慎将肠道和肝脏移向小鼠左侧，并用精细剪刀轻柔切除脾脏。
   注意：此步骤必须极为小心，因胃肠道损伤可能引起污染。
4. 将每例切除的脾脏置于含有3 mL RPMI 1640培养基的已标记15 mL锥形管中。

2. 从脾脏制备单细胞悬液

注意：可通过结合机械解离和酶消化的方法将脾脏解离为单细胞悬液。

1. 通过将胶原酶 D（1 mg/mL；冻干粉 0.29 U/mg）和 DNase I（0.1 mg/mL）加入已配制的 RPMI 1640 培养基中，制备脾脏消化液（见步骤 1.1）。
2. 使用镊子将脾脏转移至含有 3 mL 脾脏消化液的 C 管（解离管）中。
3. 根据制造商说明书，使用半自动匀浆仪进行机械解离。
   1. 将 C 管放置在半自动匀浆仪上，确保 C 管牢固安装在旋转臂上。放置完毕后，按下半自动匀浆仪上的启动按钮，运行 Spleen 04.01 程序，持续 60 秒。
      ​注意：也可通过将 40 μm 滤膜置于 50 mL 锥形管上方，轻轻研磨脾脏使其通过滤膜的方式进行机械解离。研磨完成后，用 10 mL RPMI 培养基冲洗 40 µm 滤膜。
4. 机械解离后，将管子从匀浆仪上取下，进行酶消化。将样品在 37 °C 下以持续旋转（20 rpm）条件孵育 15 分钟。
5. 经 40 µm 滤网过滤后，用移液器将溶液转移至 50 mL 锥形管中。用 10 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）冲洗 40 µm 滤网。在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
6. 离心后，彻底吸除上清液，并用 10 mL dPBS 重悬沉淀进行洗涤。在 4 °C 下以 300 x g 再次离心 10 分钟。

3. 从脾脏单细胞悬液中分离 CD11c⁺ 树突状细胞

1. 用5 mL的dPBS重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计数细胞数量。
2. 在4 °C下以300 × g离心10分钟，使细胞沉淀。
3. 完全吸除上清液，并将沉淀重悬于400 µL磁性激活细胞分选（MACs）缓冲液中。
4. 每1 × 10⁸个细胞加入100 µL CD11c微珠（见材料表）。
5. 涡旋混匀细胞悬液，并在4 °C冰箱中孵育10分钟。
6. 加入10 mL MACs缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以300 × g离心10分钟。
7. 完全吸除上清液，将沉淀重悬于500 µL MACs缓冲液中。

4. CD11c⁺ 树突状细胞的磁珠分离

注意：磁分离可使用配备LS柱的磁力分离器（见材料表）手动操作完成。磁分离也可通过自动化磁力分离器自动进行（见材料表）。

1. 将 LS 柱置于 MACS 分离器的磁场中，并在每根柱子下方放置一个 15 mL 圆底离心管以收集穿流液。
2. 用 3 mL 缓冲液冲洗 LS 柱。
3. 将细胞悬液加到每根 LS 柱上，并收集含有未标记细胞的穿流液。
4. 用 3 mL MACS 缓冲液洗涤 LS 柱，收集穿过的未标记细胞。再重复洗涤 LS 柱 2 次。
5. 从磁性分离器上取下 LS 柱。向每根柱子中加入 5 mL MACS 缓冲液，并立即用力将柱芯插入洁净的 15 mL 圆底离心管中，快速冲洗出磁性标记的细胞。
   注意：为获得高纯度的细胞悬液，对 CD11c 细胞进行二次分离至关重要。因此，请重复步骤 3.1 至 4.5，并参照 图 4 的纯度标准。此步骤可将 CD11c⁺ 细胞的纯度提高至 90–95%。
6. 使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上测定 CD11c⁺ 树突状细胞数量。将细胞样品与 0.4% 台盼蓝溶液按 1:1 比例稀释。
   注意：死细胞会被染成蓝色，而活细胞则不会着色。
   1. 为此，用 10 µL 细胞样品稀释液小心地填充血细胞计数板，孵育 1 分钟。
   2. 计数计数室中已加样区域的 4 个 1 × 1 mm² 方格内的细胞，以确定活细胞数量。

5. CD11c⁺ 树突状细胞的体外高盐处理

1. 在500 mL 1640 RPMI培养基中加入10%胎牛血清（FBS）、0.1 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇和1%青霉素/链霉素，配制DC培养液。
2. 称取1.17 g NaCl，放入无菌50 mL离心管中，配制10倍浓缩的高盐DC细胞培养液（400 mM）。向该离心管中加入50 mL无菌DC细胞培养液（按步骤5.1制备），涡旋振荡至NaCl完全溶解。
3. 立即在细胞培养超净台中使用0.2 μm滤器通过真空过滤法对高盐DC培养液进行过滤除菌。
4. 将来自脾脏的每份细胞悬液在4ºC下以300 x g 离心10分钟。将每份细胞沉淀重悬于DC培养液中，调整细胞浓度至1 x 10⁶ 个细胞/mL。
5. 用移液器将900 μL（约1 x 10⁶ 个细胞）DC细胞悬液加入24孔平底Falcon培养板中。向每孔加入100 µL高盐DC培养液，使终钠离子浓度为190 mM。标记培养板，并置于37 °C、含加湿CO₂的培养箱中培养48小时。

6. 高盐处理的CD11c⁺ 树突状细胞的过继转移

1. 体外刺激 48 小时后，将培养板从 37 °C、含 CO₂ 的恒温培养箱中取出。
2. 用移液器将细胞培养基反复吹打，以重悬 CD11c⁺ 树突状细胞（DC）。将全部 CD11c⁺ DC 悬液转移至相应标记的 1.6 mL 离心管中。对每个培养孔均重复此步骤。
3. 将每份 CD11c⁺ DC 悬液在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 10 分钟。吸除上清液，并用 100 µL 无菌 dPBS 重悬 DC 沉淀。
4. 用 27 G ½ 英寸针头连接 1 mL 注射器，吸取 DC 悬液。
5. 将 10 周龄未处理的雄性 C57bl/6 小鼠置于 2% 异氟烷麻醉下，以达到稳定的手术麻醉状态。通过脚垫反射消失确认麻醉深度。当达到稳定麻醉状态后，以约 30° 角度缓慢而小心地将针头插入小鼠眶后腔。
   注意：27 G 针头的斜面应朝下，远离眼球，以避免损伤眼部组织。
6. 缓慢平稳地注射 CD11c⁺ DC 悬液（约 1 × 10⁶ 个细胞）。注射完成后，小心地将针头从眶后腔退出，注意避免损伤眼球。
   注意：注射后应无明显出血。CD11c⁺ DC 的过继转移也可通过静脉注射方式（如尾静脉注射）进行。对照组小鼠接受在普通盐溶液培养基中培养的 CD11c⁺ DC。
7. 将小鼠从鼻罩中取出，并在麻醉恢复期间持续监测约 30 分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC/Cy7 抗小鼠 CD11c	Biolegend	117324
autoMACS 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads 超纯	Miltenyi Biotec	130-108-338
胶原酶 D	Roche	11088866001
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Roche	10104159001
不含钙和镁的 dPBS	Corning	21-031-CV
FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC 抗小鼠 CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C 管	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235	使用方案：Spleen 04.01
LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34964
LS 分选柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS 分选器	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 培养基	Gibco	11835-030