在经糖尿病型脾细胞攻击的免疫缺陷小鼠中成像转基因β细胞

摘要

来源：Stewart, T. 等，小鼠自身免疫性糖尿病过继转移模型中移植物存活的生物发光监测。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种基于成像的方法，用于可视化将表达荧光素酶的β细胞移植到非肥胖型糖尿病免疫缺陷小鼠体内。通过引入糖尿病小鼠的脾细胞，可导致β细胞进行性破坏，加入底物后发光信号逐渐减弱，可直观确认该过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 犬科审查委员会的审核。

1. NIT-1 细胞系的构建与维护

1. 在含有4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂的培养箱内，将与非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠具有相同遗传背景的NIT-1细胞系和293FT细胞培养于组织培养处理过的培养皿中。
2. 将293FT细胞培养至70%–80%融合度，用于转染。
3. 每10 cm培养皿的293FT细胞，将10 µg表达萤火虫荧光素酶转基因（luc2）的pLenti-luciferase-blast质粒（见补充文件1，该质粒在组成型活性EF1α启动子调控下表达），以及包装质粒pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev各2 µg，包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G 4 µg，线性聚乙烯亚胺（PEI）60 µg，加入1 mL无血清DMEM中混合。根据待转染细胞数量按比例调整各组分用量。
4. 将DNA、PEI和DMEM在室温（RT）孵育20分钟，然后加入293FT细胞中。
5. 转染后48小时收集含有慢病毒颗粒的培养基。
6. 以每10⁶个细胞加入1 mL含慢病毒颗粒的培养基，对约80%融合度的NIT-1细胞进行转导，持续48–72小时。
7. 使用5 µg/mL杀稻瘟菌素对表达荧光素酶的细胞进行48小时筛选。
8. 进一步根据实验需求对表达荧光素酶的细胞进行遗传修饰。同时应设置表达荧光素酶的野生型或非靶向对照细胞系作为比较。
   注意：靶基因修饰的示例包括规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）敲除、CRISPR激活/抑制（CRISPRa/i）、shRNA敲低以及基因过表达。

2. 移植用NIT-1细胞的制备

1. 将表达荧光素酶的细胞培养至融合度达到80%–90%。
2. 移除生长培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS，每10 cm培养皿使用5 mL）洗涤细胞。
3. 每皿加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA），作用2分钟。
4. 加入5 mL生长培养基以中和胰蛋白酶。
5. 用移液器将细胞从培养皿上吹下，并转移至锥形管中。
   注意：相同细胞系的多个培养皿中的细胞可合并处理。
6. 使用台盼蓝等染料，通过血细胞计数板手动或使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
7. 在室温下以250 × g 离心5分钟，并用抽吸式移液器移除上清液。
8. 将细胞沉淀重悬于PBS中，调整细胞浓度至5 × 10⁷ 个细胞/mL（每只小鼠每种细胞系将移植10⁷ 个细胞，体积为200 µL）。
9. 将细胞置于冰上保存（最多3小时），直至进行移植。

3. 将 NIT-1 细胞移植到非肥胖型糖尿病-严重联合免疫缺陷（NOD-scid）小鼠体内

1. 使用异氟烷吸入法在麻醉诱导室中对受体小鼠（与分离脾细胞所用小鼠同性别、8–10周龄的NOD-scid小鼠）进行麻醉。以1.5 L/min的气流速度向室内输送2.5%异氟烷，同时以9 L/min的速度进行排气。
2. 用眼膏润滑动物的眼睛，以防止干燥。
3. 使用带保护罩的电动剃须刀，剃除小鼠背部（背侧）的毛发以暴露皮肤。剃毛后的移植区域约为1英寸×2英寸。将剃毛后的小鼠放回麻醉室，直至进行移植。
4. 将小鼠逐只转移至带有异氟烷鼻罩的清洁表面。轻柔地将小鼠头部引导进入鼻罩内。移植过程中，以0.25 L/min的异氟烷流速维持麻醉。
5. 用异丙醇消毒垫擦拭移植区域，以去除松散的毛发并消毒皮肤。
6. 确保细胞完全重悬后再装入注射器。吸取过量体积（>将300 µL细胞加入带有26 G针头的1 mL无菌注射器中。去除气泡，然后将多余的细胞返回至管中，使注射器内剩余300 µL细胞悬液。
7. 用非优势手持一对弯镊，轻轻提起小鼠背部一侧（左侧或右侧）的皮肤，以便更易于进入皮下空间。
8. 用惯用手将注射器置于与小鼠身体冠状面和矢状面平行的位置。针尖朝向小鼠头部，将针头刺入后躯附近的皮肤，并轻柔地引导其进入皮下间隙。确保整个针头始终保持在皮肤下方，避免穿出。
9. 用镊子轻轻夹住针头基部周围的皮肤。缓慢注入少量细胞悬液（<50 µL），并确认注射部位皮下形成微小隆起。继续注射细胞悬液，直至皮下注射总量达到 200 µL。
10. 保持镊子位置不动，并使针头与小鼠身体平行，缓慢抽出针头。拔出针头后，用镊子夹住皮肤切口数秒钟，以防止细胞从穿刺伤口漏出。
11. 若需评估基因修饰效果，应使用不同的注射器在小鼠对侧重复移植操作，使每只小鼠同时接种突变型和对照细胞，左侧接种一种细胞系，右侧接种另一种细胞系。若仅移植一种细胞系，则仅在一侧注射细胞。
12. 移植后，将每只小鼠转移至新的笼子中。在向笼中添加其他小鼠之前，应确保每只小鼠已从麻醉中完全恢复。
    注意： 当小鼠恢复正常的活动能力，且无嗜睡或运动障碍迹象时，视为已恢复。
13. 每天评估小鼠在移植后整个实验期间的健康状况。如果移植物形成明显隆起，或小鼠出现虚弱、精神萎靡等症状，应检测其血糖水平，并提供10%（w/w）蔗糖水 随意摄取 向所有低血糖小鼠实施安乐死。遵循所有兽医建议，并根据机构指南对持续身体状况不佳的小鼠实施安乐死。本研究中，小鼠通过CO₂ 吸入麻醉后行颈椎脱位处死。

4. 自体反应性脾细胞的分离与纯化

1. 使用尿液（或血液）葡萄糖试纸鉴定 10 至 16 周龄、新近发病（发病时间少于 10 天）的雄性或雌性 NOD 小鼠。当 NOD 小鼠连续两天尿液/血液葡萄糖水平 ≥250 mg/dL 时，即可判定为糖尿病。
   注意： 每只 NOD-scid 小鼠需要 1000 万个脾细胞；通常一个脾脏可获得 5000 万至 1.5 亿个脾细胞。脾细胞来源于饲养在哨兵鼠监测设施中的无病原体小鼠。
2. 处死适量数量的糖尿病 NOD 小鼠。
   注意： 在本研究中，小鼠通过吸入 CO₂ 并辅以颈椎脱位的方式处死，以确保死亡。
3. 将小鼠仰卧放置，用手术剪在皮肤上做一个约 2 英寸长的纵向切口。从操作者视角打开小鼠右侧，找到鲜红色的脾脏。小心地将脾脏从粉红色的胰腺上分离，并转移至含有 5 mL 无菌 PBS 的无菌 10 cm 培养皿中。根据需要重复解剖操作。
   注意： 多只小鼠的脾脏可合并置于同一个培养皿中。后续步骤应在无菌操作台中使用无菌试剂和器械进行。
4. 用无菌注射器活塞的平头碾压脾脏（或脾脏组织）。
5. 将 40 µm 或 70 µm 细胞筛置于 50 mL 锥形管上，加入 5 mL PBS 润洗以预湿筛网。将脾脏悬液转移至筛网上，并继续轻轻碾压使其通过筛网。用 10 mL PBS 冲洗培养皿，并将冲洗液转移至筛网。持续碾压直至筛网上无红色残留。
6. 弃去筛网，将锥形管在 500 × g 条件下离心 5 分钟（室温）。用移液器吸除上清液。
7. 将细胞沉淀重悬于 5 mL（最多三只脾脏）室温预热的 ACK 裂解缓冲液中，裂解红细胞 4 分钟。若需处理更多脾脏，每增加一个脾脏应额外增加 1–2 mL 裂解缓冲液体积。
8. 每 5 mL 裂解缓冲液加入 5 mL NIT-1 细胞培养基（如上所述）以终止反应。将细胞悬液通过新的细胞筛以去除团块。弃去筛网，于 500 × g 离心 5 分钟（室温）。
9. 将细胞沉淀重悬于 20 mL PBS 中，并进行细胞计数。在 500 × g 条件下离心 5 分钟（室温）。将细胞重悬于无菌 PBS 中，调整浓度至 1 × 10⁸ 个细胞/mL（注射体积为每只小鼠 0.1 mL），置于 1.5 mL 安全锁反应管中。
10. 将细胞置于冰上（不超过 1 小时）或在室温保存，并立即进行尾静脉注射。

5. 糖尿病小鼠脾细胞的静脉注射 通过 尾侧静脉

1. 预热成年受体 NOD-scid 小鼠的体温（例如.使用加热灯照射约5-10分钟，以扩张静脉（有助于静脉的可视化及静脉注射）。
   注意： 为避免小鼠过热，切勿超过此时间。需始终监测小鼠的健康状况。若小鼠出现疲惫或不动的情况，应立即关闭加热灯。
2. 预热细胞悬液。准备一支无菌注射器（0.3–1.0 mL）并安装无菌针头（27–30 G，0.3 mm/0.5 英寸或更小），或使用带 0.3 mm（0.5 英寸）针头的无菌 0.5 mL 胰岛素注射器。操作过程中始终保持针头无菌；若需在注射间隙放置注射器，应将其置于无菌托盘中。
3. 每次注射前重悬脾细胞悬液。每只小鼠取100 µL预热并混匀的脾细胞悬液加入注射器中。确保注射器及悬液中无气泡。
   注意： 确保在将小鼠放入固定装置前，已准备好所有设备和用品（用于消毒的酒精棉片、装有待注射脾细胞的注射器，以及用于隔离已注射小鼠的新笼子）。
4. 将小鼠放入固定装置中。用非惯用手抓住尾巴，找到两条侧尾静脉中的一条。必要时可轻轻旋转尾巴。用消毒湿巾（70%异丙醇）擦拭尾巴，以清洁皮肤并增强静脉的可见度。
5. 用惯用手以较小的角度将针头插入尾巴中央区域。针尖斜面朝上，沿皮肤推进数毫米。
   注意： 确保针头与静脉平行，并刚好置于皮肤下方。穿刺皮肤或血管壁后，需防备小鼠/尾部突然移动。针头成功插入静脉时应有“顺滑滑入”的感觉。若需再次尝试，应向尾部近体端方向上移。
6. 轻轻按压注射器以注入脾细胞悬液。注射时切勿使针头进一步深入或退出。成功的注射过程应顺畅，无回弹阻力感，且注射后立即可见透明/白色血液流动。
7. 轻轻将针头从静脉中抽出，用消毒棉片对尾部施加轻压，直至出血停止。将小鼠从固定装置中释放，并轻柔地转移至新准备的笼子中。
   注意： 注射2至3只未接受NIT-1细胞移植的对照小鼠，给予脾细胞，以确认自身反应性脾细胞诱导糖尿病的潜力，该过程大约在注射后2-4周内发生。

6. 体内 NIT-1 移植物的生物发光成像

注意：每周对移植物进行一到两次成像。在移植当天，需等待至少 2 小时后再进行成像，以使移植物充分稳定并确保荧光素酶表达的稳定性。如果时间有限，可将首次检测推迟至第 1 天进行。建议的初始成像时间点为注射后第 0 天或第 1 天、第 5 天、第 10 天、第 14 天、第 18 天和第 25 天。然而，应根据自身免疫进展的情况（通过生物发光信号的减弱程度判断）对成像时间表进行相应调整。

1. 在杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中配制15 mg/mL的D-荧光素溶液。室温下振荡溶解，经0.22 µm滤膜无菌过滤。分装为1 mL每份，于−20 °C保存，按需解冻使用。
   注意： 分装样品可再次冷冻。
2. 成像前至少5分钟，使用1 mL注射器和26 G针头，按150 mg/kg剂量经腹腔注射D-luciferin溶液。
   注意： 每只小鼠使用一支新的注射器和针头。
3. 根据机构指南，通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。推荐条件为：向麻醉诱导室中通入2.5%异氟烷，气体流速为1.5 L/min，排出流速为9 L/min。
4. 用眼用软膏润滑动物的眼睛，以防止干燥。
5. 打开与成像仪器配套的软件。创建一个 新用户 和/或 登录. 在 控制面板 在右下角选择 初始化 (图1A）。为了 自动保存 成像数据，创建适当的 文件夹 在计算机上，然后选择 采集 | 自动保存至… (图1A）。仪器初始化完成后，设置 曝光时间 到 1 分钟.
   注意： 完整的成像参数如图所示 图1B.
6. 将小鼠逐只从麻醉室转移至成像仪器。将小鼠腹部朝下放置，四肢自然伸展，并轻柔地引导其头部进入鼻罩。异氟烷输送流速为0.25 L/min 通过 鼻锥适于在成像过程中维持麻醉状态。用双手轻压小鼠背部中央，然后双手向外侧分开并轻轻按压，使其身体平展。
7. 选择 获取 (图1B）。在弹出窗口中记录实验的任何相关细节（图1C).
   注意： 参见 图2A 三只8周龄雌性NOD-scid小鼠移植两块移植物后在不同时间点的代表性图像。

结果

图1：用于成像生物发光移植物的软件操作界面截图。（A）成像前，选择初始化以准备仪器。可通过选择采集 | 自动保存至…将图像自动保存至指定文件夹。（B）成像参数概览。将小鼠放置于仪器中后，点击采集。（C）成像过程中弹出的对话框截图。此处可输入时间点、小鼠品系等详细信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA	Corning	25-052-CI
293FT	Invitrogen	R70007	源自表达SV40大T抗原的人胚胎肾细胞的快速生长、高转染效率克隆株
ACK裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
酒精消毒垫，70%异丙醇	Amazon/Ever Ready First Aid	B08NWF31DX
BD 5 mL 注射器，鲁尔锁扣式针头	BD	309646
BD PrecisionGlide 针头 26G × 5/8 (0.45 mm × 16 mm)，皮下注射用	BD	305115
BD 1 mL TB 注射器，滑动式针头	BD	309659
Blasticidin S HCl	Corning	30-100-RB
Cell strainer premium SureStrain，70 µm，无菌	Southern Labware	C4070	或使用孔径为40–70 µm的类似无菌滤网
CellDrop全自动细胞计数仪	Denovix	CellDrop BF-PAYG	或使用类似的细胞计数设备
Corning 100 mL 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩	Corning	30-002-CI
一次性吸液移液管，聚苯乙烯材质，无菌，容量=2 mL	VWR	414004-265	或使用类似的吸液移液管
D-荧光素钾盐，分子生物学级，粉末，>99%	Goldbio	LUCK-100
DMEM，高糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺	Gibco	10313039
Falcon BD 离心管，50 mL	Fisher Scientific	14-959-49A
胎牛血清	Gibco	10437-028
组织用优质镊子，1×2齿，5英寸，德国钢	Fisher Scientific	13-820-074
葡萄糖尿检试纸	California Pet Pharmacy	u-tsg100	或使用用于尿液/血液葡萄糖检测的类似试纸
GlutaMAX–1 (100x)	Gibco	35050-061
红外加热灯	Cole Parmer	03057-00	或使用类似的红外灯
胰岛素注射器，0.5 mL，U-100，29 G，0.5英寸	Becton Dickinson	309306
异氟烷，USP级	Piramal Critical Care	6679401725
IVIS Spectrum活体成像系统	Perkin Elmer	124262	用于非侵入性采集移植细胞的生物发光图像的仪器
Living Image分析软件	Perkin Elmer	128113	用于采集和定量生物发光信号的软件
Microcentrifuge tubes seal-rite，1.5 mL	USA Scientific	1615-5510	或使用类似的无菌微量离心管
NIT-1	ATCC	CRL-2055	源自NOD/Lt小鼠的胰岛β细胞系
NOD.Cg-Prkdcscid/J	The Jackson Laboratory	1303	该品系小鼠对严重联合免疫缺陷自发突变Prkdcscid呈纯合状态，通常称为scid小鼠，其特征为缺乏功能性T细胞和B细胞、淋巴细胞减少、低丙种球蛋白血症以及正常的造血微环境
NOD/ShiLtJ	The Jackson Laboratory	1976	NOD/ShiLtJ小鼠品系（通常称为NOD）是多基因自身免疫性1型糖尿病模型
PBS，pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010031	不含钙、不含镁、不含酚红
pCMV-VSV-G	Addgene	8454
pLenti-luciferase-blast	本实验室制备	质粒可应要求提供	参见补充文件1
pMD2.G	Addgene	12259
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
聚乙烯亚胺，线性，分子量25,000，转染级（PEI 25K）	Fisher Scientific	NC1014320
pRSV-Rev	Addgene	12253
啮齿类动物固定器，布鲁姆式圆形，1英寸	Fisher Scientific	01-288-32A
剪刀，尖头型	Fisher Scientific	08-940	或使用其他外科级不锈钢材质的剪刀
组织培养处理培养皿	Millipore Sigma	CLS430167-20EA	或使用其他无菌细胞培养处理的培养皿
镊子/止血钳，中等尖端精细型	Fisher Scientific	12-000-157