小鼠模型中使用减毒活子孢子进行皮内免疫

摘要

来源：Mac-Daniel, L., 等 小鼠经皮内接种减毒活疫苗后皮肤及引流淋巴结中髓系细胞的分离 疟原虫 子孢子。 视频实验杂志 (2016).

本视频展示了一种使用减毒子孢子对小鼠模型进行免疫的实验方法。将经辐射减毒的疟原虫子孢子注射至小鼠耳背部。在双耳多个位点完成注射后，让小鼠恢复。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 材料与试剂

1. 使用雌性Anopheles stephensi蚊子（Sda500品系），在羽化后3-5天让其取食感染的小鼠血液，并按先前所述方法饲养。
2. 使用表达绿色荧光蛋白（GFP）基因的Plasmodium berghei ANKA克隆，该基因在组成型热休克蛋白70（HSP70）启动子的调控下表达，可在寄生虫整个生命周期中产生强烈的荧光信号。
3. 使用雌性C57BL/6JRj小鼠（7周龄）。
   注意：本方案中使用的所有试剂均列于材料/设备表中。

2. 从蚊子唾液腺中分离辐射减毒子孢子

1. 在感染性血液餐后18至25天，按先前所述方法将蚊子收集并置于冰上的15 ml离心管中进行低温麻醉。通过倒置离心管小心地将蚊子转移至培养皿中。保持昆虫处于冰上，并暴露于12 krad剂量的γ射线或x射线辐照。
2. 按先前所述方法从经辐照的蚊子唾液腺中分离减毒子孢子。在冰上用少量（约15 μl）1×杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）收集感染的唾液腺，并轻轻研磨以释放子孢子。
   注意：由于在小体积内注射高浓度寄生虫悬液至关重要，因此必须从大量预先筛选的高感染蚊子（以其强烈的绿色荧光表达为依据）中收获足够数量的唾液腺。
3. 将子孢子悬液通过装有35 µm细胞滤器帽的低吸附1.5 ml微量离心管过滤，以去除团块和蚊子残渣。
4. 按先前所述方法计数所分离的子孢子总数，并用冷的1×DPBS调整寄生虫悬液浓度至83,000 子孢子/μl。在进行后续步骤时将寄生虫置于冰上保存。
5. 收集未感染蚊子的等量唾液腺作为阴性对照，并按照步骤2.2和2.3所述处理样本。按上述说明稀释样本，使悬液中唾液腺提取物的浓度相近。
   注意：子孢子可在冰上保存最多2小时。然而，理想情况下应在研磨唾液腺后1小时内完成注射。

3. 将子孢子注射至耳部真皮层

1. 通过腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）混合物麻醉动物。等待5-8分钟，直至小鼠进入无意识状态，并在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。通过轻轻夹捏双侧后肢脚趾来评估麻醉深度。
   注意：麻醉剂量的作用时间少于20分钟，因此后续步骤必须迅速完成。
2. 在体视显微镜下，用预先放置的透明胶带固定小鼠耳廓腹侧以稳定耳部（图1A）。轻柔按压耳朵，避免损伤血管系统。
3. 用重悬的寄生虫液填充一支10 μl注射器配35号斜面针头，体积为0.6 µl。
4. 将子孢子悬液分4个注射位点注入耳背侧（每个位点0.15 µl），将针头斜面向上，小心刺入表皮下方的真皮层（图1A），注意避开任何血管。注射后保持针头在真皮内数秒，以防止药液回流，再将其抽出。操作结束后，每个注射位点应出现特征性的丘疹（图1B和1C）。
5. 注射完成后，小心将耳朵从胶带上取下。
6. 按照步骤3.2–3.4，对对侧耳朵注射相同剂量的寄生虫。
7. 另注射2只小鼠，分别给予0.6 µl的1×DPBS或0.6 µl的1×DPBS加未感染蚊虫的唾液腺提取物，以评估单纯注射引起的炎症反应以及蚊虫物质在真皮层的沉积情况。
8. 将小鼠放回笼中前，密切监测其从麻醉状态恢复的情况。
   注意：可通过荧光显微镜观察小鼠皮肤中子孢子的正确沉积情况（图2A和2B），小鼠制备方法如前所述。

结果

图1： I小鼠耳部皮内注射子孢子. (A) 图像显示在麻醉小鼠耳廓进行子孢子皮内注射。在解剖显微镜下预先用透明胶带固定耳部腹侧。针头斜面向上，从耳部背侧小心插入表皮下方。B-C) 显示耳廓背侧在之前（B）以及之后（C皮内注射0.1–0.2 μl寄生虫悬液。操作结束时，注射部位可见典型丘疹（黑箭头）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮：Imalgene® 1000	Merial	-	-
赛拉嗪：Rompun® 2%	Bayer	-	-
NanoFil 注射器 + 35 号针头	World Precision Instruments	-	-
Omnican® 50 胰岛素注射器 0.5 ml/50 I.U.	B. Braun Medical	9151125	-
MultiwellTM 6 孔组织培养板 – 平底	BD Falcon	353046	-
70 µm 细胞滤器	BD Falcon	352350	-
2 ml 注射器	Terumo	SS-02S	-
BLUE MAXTM 15 ml 聚丙烯圆锥形离心管	BD Falcon	352097	-
BLUE MAXTM 50 ml 聚丙烯圆锥形离心管	BD Falcon	352098	-
5 ml 聚苯乙烯圆底管，带 35 µm 滤网盖	BD Falcon	352235	-
DPBS 1X，无 CaCl2 和 MgCl2	Life Technologies	14190-094	-
DMEM 1X + GlutaMAXTM	Life Technologies	31966-021	-
牛胰脱氧核糖核酸酶 I，IV 型	Sigma-Aldrich	D5025	50 µg/ml
雌性 C57BL/6JRj 小鼠（7 周龄）	Janvier Laboratories	-	-