由诱导性多能干细胞生成单阳性CD8 T细胞

摘要

来源：Good, M. L., 等. 利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于生成肿瘤抗原特异性的诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8αβ+ T细胞的实验方法。将肿瘤抗原特异性的iPSC在基质细胞单层上培养，并分化为造血祖细胞（HPCs）。随后，利用分化培养基将HPCs分化为CD4+ CD8+ 双阳性T细胞。再通过刺激这些细胞，生成表达CD8的单阳性T细胞。

方案

1. 在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上培养人诱导多能干细胞（hiPSCs）

注意：也可采用其他方法培养 hiPSCs，包括但不限于将细胞接种至预先包被明胶、明胶蛋白混合物、重组层粘连蛋白 511 或任何其他用于 hiPSC 扩增的细胞外基质的 6 孔板中，并使用专为人类多能干细胞培养配制的定义培养基进行培养。

1. MEF 培养
   1. 用 4 mL 的 0.1% 明胶包被一个 10 cm 的细胞培养培养皿，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   2. 将一管含有 4 × 10⁶ 个经辐照处理的 MEF 快速解冻至 10 mL 37 °C 的 MEF 培养基中（DMEM 高糖培养基 [Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM] + 10% 胎牛血清 [FBS] + 1× 青霉素-链霉素 + 1× L-谷氨酰胺补充剂）。在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 9 mL MEF 培养基中。
   3. 从培养箱中取出明胶包被的培养皿，吸除明胶溶液，加入 7 mL MEF 培养基。将 3 mL MEF 悬液（来自步骤 1.1.2）接种至明胶包被的培养皿中。轻轻左右及前后摇动培养皿，确保 MEF 在皿底均匀分布。在 37 °C 下孵育 8–36 小时。
2. 在 MEF 上传代 hiPSC
   注意：本实验数据来源于长期培养的黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）所衍生的 MART-1（黑色素瘤抗原 T 细胞识别 1）诱导多能干细胞（iPSC），该细胞特异性识别在人类白细胞抗原（HLA）-A*02:01 背景下的 MART-1 肽段。
   1. 当 hiPSC 克隆直径达到 0.8–1.2 mm 时进行传代。传代前，在体视显微镜下检查 hiPSC 克隆，并使用 200 µL 移液枪头的塑料边缘去除培养物中已分化的区域。
   2. 吸除旧培养基，加入 10 mL hiPSC 培养基（人胚胎干细胞 [ES] 培养基 [材料表] + 10 ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子 [hbFGF]），并补充 10 μM Rho 相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。
   3. 一手持培养皿，另一手持一次性细胞传代工具，沿单一方向在整个培养皿表面滚动。施加足够压力，使滚刀整个刃面接触培养皿底面，并在滚动过程中保持压力均匀。
   4. 将培养皿旋转 90°，重复步骤 1.2.3。在显微镜下观察培养皿，确认克隆被正确切割成棋盘状。使用 200 μL 移液器轻柔吹打，通过机械方式使切割后的克隆脱落。
      注意：切割后必须立即进行吹打使克隆脱落，因为切割 3 分钟后，克隆将开始重新贴附于培养皿表面，导致难以通过吹打获得大小均一的细胞团。
   5. 将 350–600 个切割后的克隆团块转移至一个新的 10 cm MEF 培养皿（该 MEF 应在 hiPSC 传代前 8–36 小时铺板），加入 10 mL 新鲜 hiPSC 培养基，并补充 10 μM ROCK 抑制剂。在 37 °C 下孵育。
      注意：600 个团块约相当于 1.0 × 10⁶ 个 MART-1 iPSC，在第 35 天可产生 0.5–1.0 × 10⁶ 个 DP 细胞。然而，实际数量会因起始细胞系的潜能及培养条件的不同而有所差异。
   6. 次日，吸除旧培养基，加入 10 mL 新鲜 hiPSC 培养基。根据 hiPSC 的生长速度，每 1–2 天更换一次培养基。

2. 准备用于与hiPSCs共培养的OP9/DLL1细胞

1. 在OP9培养基[α-最小必需培养基（α-MEM）+ 20% 胎牛血清（FBS）+ 1×青霉素-链霉素]中，于37 °C培养OP9/DLL1细胞。当OP9/DLL1细胞达到汇合状态时，吸除培养基，并用5 mL不含镁、钙和酚红的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
2. 吸除PBS，加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），于37 °C孵育5分钟。然后加入4 mL OP9培养基，通过移液器吹打使细胞层机械解离，形成单细胞悬液。
3. 将细胞悬液经100 μm细胞滤网转移至50 mL锥形管中，以避免细胞团块。在4 °C下以300 x g离心5分钟。吸除上清液，用12 mL OP9培养基重悬细胞。
4. 向六个新的10 cm细胞培养培养皿中各加入8 mL OP9培养基。将步骤2.3中制备的OP9/DLL1细胞悬液各2 mL接种至每个新的10 cm培养皿中。轻轻左右摇动培养皿，再前后摇动，以确保OP9/DLL1细胞在培养皿中均匀分布。
5. 于37 °C孵育。当细胞达到汇合状态时，每2–3天传代一次。
   注意：务必制备足够量的OP9/DLL1细胞冻存储备，并每隔4–6周复苏一批新储备。

3. 将人诱导多能干细胞体外分化为CD8αβ+单阳性（SP）T细胞

1. 在与hiPSCs共培养前一周制备明胶包被的OP9/DLL1培养皿。配制0.1%明胶溶液时，将5 mL室温（RT）组织级明胶储备液加入500 mL PBS中。
   1. 向3个新的10 cm细胞培养培养皿中分别加入4 mL 0.1%明胶进行包被，37 °C孵育30分钟。
   2. 吸除明胶，每皿加入8 mL OP9培养基。将一皿汇合的OP9/DLL1细胞（如上文第2节所述）传代至三皿预先包被明胶的培养皿中。
2. 4天后，向每块含OP9/DLL1的10 cm凝胶培养皿中加入10 mL OP9培养基，使每皿培养基总体积达到20 mL。
3. 7至8天后，开始将hiPSC与汇合的OP9/DLL1培养皿进行共培养（分化第0天）。
   1. 从长满hiPSCs的10 cm培养皿（饲养层为MEF）中吸除用过的培养基，加入10 mL OP9培养基。使用一次性细胞传代工具切割并分离hiPSC克隆，操作步骤同1.2.3和1.2.4。
   2. 使用200 μL移液器将350–600团切割后的克隆转移至含10 mL新鲜OP9培养基的10 cm预明胶化OP9/DLL1培养皿（步骤3.1）中。轻轻左右摇晃培养皿，再前后摇晃，以确保克隆均匀分布。
      注意： 或者，也可使用预先形成的hiPSC拟胚体（EBs）或小团块悬浮液。然而，更推荐使用一次性细胞传代工具或EB形成系统来制备大小均一的hiPSC细胞团块。
4. 第1天，吸除用过的培养基，更换为20 mL新鲜的OP9培养基。在OP9/DLL1上共培养1天后，hiPSC细胞团将呈现为小的圆形单层克隆（图1).
5. 第5天，吸除10 mL用过的培养基，加入10 mL新鲜OP9培养基。hiPSC集落将开始分化为原始中胚层，表现为具有多层深色中心的形态特征。
6. 第9天，吸出10 mL用过的培养基，加入10 mL新鲜的OP9培养基。此时，多层中心结构将发育为圆顶状，周围将出现明显的网状区域。
7. 第13天，收获造血祖细胞（HPCs）（图1）。第13天的hiPSC来源结构特征为中央有一个深色类器官，周围环绕着呈圆顶状区域的网络结构，这些圆顶状区域代表此前报道的造血区（HZs），可包绕人胚胎干细胞来源的造血祖细胞。
   注意： 穹窿样结构的存在表明该过程已成功，即使缺乏深色中心亦是如此。无法生成造血前体细胞（HPCs）的原因可能包括OP9/DLL1细胞质量不佳、胎牛血清（FBS）批次质量差、接种于OP9/DLL1上的iPSC细胞团汇合度不适宜（350–600个细胞团为最佳范围），和/或不同iPSC细胞系在生成造血前体细胞方面的潜能存在差异。
   1. 吸弃旧培养基，用 5 mL 含钙镁的 1× 酚红-free 亨克氏平衡盐溶液（HBSS）洗涤 1 次。
   2. 吸弃 HBSS，加入含 5000 Units/mL 胶原酶 IV 的 10 mL HBSS，终体积中胶原酶 IV 用量为 250 μL。于 37 °C 孵育 45 分钟。吸弃含胶原酶 IV 的 HBSS，用 5 mL PBS 洗涤一次。
   3. 吸弃 PBS，加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C 下孵育 20 分钟。然后加入 4 mL OP9 培养基，通过吹打使细胞层解离，制成单细胞悬液。
   4. 将细胞悬液通过100 μm细胞筛滤器转移至50 mL锥形管中。以300 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于10 mL OP9培养基中。
   5. 将细胞悬液接种至新的明胶包被的10 cm细胞培养培养皿中（参见步骤3.1.1和3.1.2）。在37 °C孵育45分钟。随后，通过轻柔吹打收集非贴壁细胞。
   6. 将收集的细胞悬液通过100 μm细胞筛滤后转移至50 mL锥形管中。以300 x g 4 °C下离心5分钟。吸去上清液，加入10 mL分化培养基[OP9培养基，含5 ng/mL人干细胞因子（hSCF）、5 ng/mL人Flt3配体（hFLT3L）和5 ng/mL人白细胞介素7（hIL-7）]重悬细胞。
   7. 将细胞悬液接种至新的10 cm OP9/DLL1融合培养皿中。
8. 第16天，传代细胞。
   1. 通过轻柔吹打机械性分离非贴壁细胞，并经100 μm细胞滤网过滤。300 × g离心 x g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液，加入10 mL分化培养基重悬。
   2. 将细胞悬液接种至新的10 cm OP9/DLL1融合培养皿中。
9. 此后每5-7天重复步骤3.8，对非贴壁细胞进行传代培养。
10. 第35天，富集CD4+CD8+双阳性（DP）细胞群，并刺激其分化为CD8αβ+单阳性（SP）T细胞（图2）。
    1. 通过轻轻吹打并使用100 μm细胞筛过滤，机械分离非贴壁细胞以去除细胞团块。根据生产商说明书，采用CD4磁珠分离法富集CD4+细胞群体。
       注意： 使用CD4磁珠的原理是去除培养物中的CD4-CD8-双阴性（DN）细胞，因为已有研究表明，这些细胞在受到刺激后会直接杀伤CD4+CD8+双阳性（DP）细胞。
    2. 使用Neubauer血细胞计数板和台盼蓝染色计数活的CD4富集细胞。用OP9培养基重悬，调整总浓度为0.5 × 10⁶个细胞/mL。⁶ 细胞/mL。取1 mL细胞悬液（0.5 × 10⁶ 将细胞接种至含有融合OP9/DLL1细胞的24孔组织培养平底板的每个孔中。
    3. 加入100 IU人白细胞介素2（hIL-2）、5 ng/mL hIL-7、500 ng/mL抗人CD3抗体和2 μg/mL抗人CD28抗体，于37 °C培养。

结果

图 1：由 hiPSC 诱导生成造血祖细胞。（A）通过 OP9/DLL1 共培养体系将 hiPSC 分化为造血谱系的示意图。（B）hiPSC 诱导结构在第 1 天（左上）、第 3 天（右上）、第 7 天（左下）和第 13 天（右下）的形态。比例尺 = 100 µm。（C）第 13 天 hiPSC 诱导的 CD34+CD43+ 造血祖细胞的流式细胞术分析。数据来自六次独立实验（n = 1 至 2）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	Corning, Inc.	353003
抗人 CD3 抗体	BD Biosciences	Cat# 561812, RRID:AB_1089628
抗人 CD34 抗体	BD Biosciences	Cat# 348791, RRID:AB_400381
抗人 CD4 抗体	Biolegend	Cat# 344612, RRID:AB_2028479
抗人 CD43 抗体	BD Biosciences	Cat# 560198, RRID:AB_1645460
抗人 CD7 抗体	BD Biosciences	Cat# 555361, RRID:AB_395764
抗人 CD8a 抗体	BD Biosciences	Cat# 555369, RRID:AB_398595
抗人 CD8b 抗体	BD Biosciences	Cat# 641057, RRID:AB_1645747
抗人 TCRb 抗体	BD Biosciences	Cat# 555548, RRID:AB_395932
人源 CD28 单克隆抗体 (15E8)，纯化功能级	Miltenyl Biotec	130-093-375
人源 CD3 单克隆抗体 (OKT3)，纯化功能级	Miltenyl Biotec	130-093-387
人源 CD4 微珠	Miltenyl Biotec	130-045-101
100 µm 细胞筛	Fisher Scientific	22-363-549
胎牛血清 (FBS)	Gemini	100-500
Flt-3 配体	R&D Systems	427-FL
2% 明胶溶液	SIGMA-Aldritch	G1393-100ML
GlutaMAX (100X)	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-谷氨酰胺补充剂
无酚红 HBSS（含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺）	Gibco	14025-092
白细胞介素-2	R&D Systems	202-IL
白细胞介素-7	R&D Systems	407-ML
iTAG MHC 四聚体 HLA-A*0201 Mart1 四聚体 -ELAGIGILTV	MBL	Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC	Vizcardo 等，Cell Stem Cell 2013	RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35)	InnoPep	3146-0100
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050
αMEM 粉末	Gibco	61100061
小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)	Thermo Fisher Scientific	C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962
OP9/N-DLL1	Riken 生物资源中心	Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220	OP9/DLL1
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140-122
磷酸盐缓冲液 pH 7.4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
灵长类动物 ES 细胞培养基	Reprocell	RCHEMD001	人 ESC 培养基
Rhok 抑制剂 (Y-27632 二盐酸盐)	Tocris	1254
RPMI 1640	Gibco	11875093
干细胞因子 (SCF)	R&D Systems	455-MC
StemPro	EZPassage	23181-010
T2-肿瘤细胞	ATCC	T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™)
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Thermo Fisher Scientific	25300-062
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红	Thermo Fisher Scientific	25200-072
U 型底 96 孔板	Corning, Inc.	3799