用于成像质谱流式的组织免疫染色

摘要

来源：
Jake Griner¹, Arwen Wedgeworth², Brenton Puckett², Kacey Idouchi¹, Slivia Guglietta², Carsten Krieg<sup>1

1</sup>美国南卡罗来纳医科大学病理学与实验医学系。

²美国南卡罗来纳医科大学再生医学与细胞生物学系。

该视频介绍了用于成像质谱流式细胞术的组织样本制备过程。首先对组织进行处理，以暴露抗原表位、通透细胞膜，并封闭非特异性抗体结合位点。随后，将组织与金属标记的抗体混合物及核染料共同孵育。最后，使用光学扫描仪对处理后的组织样本进行成像。

方案

1. 组织预处理：

对于新鲜冷冻组织：

1. 使用前至少一小时，将玻璃染色缸放入 -20°C 冰箱中预冷。
2. 从 -80°C 冰箱中取出载玻片，放入置于 -20°C 冰箱中的玻璃染色缸内，静置至少 15 分钟。
3. 在通风橱内，使用安瓿瓶切割器打开 16% 多聚甲醛（PFA）玻璃安瓿瓶，并妥善丢弃破碎的玻璃。
4. 向塑料染色缸中加入 10 mL 的 16% PFA 和 30 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），确保 PBS 已预先冷却至 4°C。
5. 将该溶液转移至 4°C 冰箱中，静置至少 15 分钟。
6. 15 分钟后，将装有载玻片的玻璃染色缸转移至 4°C 冰箱中，继续放置 10 分钟。
7. 将载玻片从玻璃染色缸转移至含有冷的 4% PFA 溶液的塑料染色缸中。
8. 在冰箱中用 4% PFA 固定载玻片 30 分钟。
9. 用室温 PBS 漂洗载玻片三次，每次 5 分钟，确保每次漂洗之间充分冲洗。

对于福尔马林固定石蜡包埋组织：

1. 从贴附在带正电荷的标准显微镜载玻片上的5 µm福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片开始。
2. 将载玻片在60°C下加热1小时以脱蜡。 
3. 取出载玻片，室温下冷却约5分钟。
4. 将载玻片放入载玻片盒中，在二甲苯浴中清洗两次，每次3分钟。 
5. 再用100%乙醇清洗两次，每次1分钟。 
6. 同样地，分别用95%和70%乙醇各清洗1分钟。 
7. 最后，用蒸馏水清洗两次，每次3分钟。
   注意： Hyperion系统无法在距载玻片边缘2 mm范围内进行消融，请尽量将组织置于中心位置。 

2. 热诱导表位修复（HIER）

1. 准备 Tris-乙二胺四乙酸（EDTA）pH9 缓冲液：
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER 缓冲液以 100 倍浓度购入，使用高效液相色谱（HPLC）水稀释至 1 倍浓度。 
   2. 示例：将 2.5 mL Abcam ab93684 加入 247.5 mL HPLC 水中。 
      注意：超过六个月的缓冲液不应使用。
2. 设置脱封闭室以加热切片。首先，在脱封闭室底部加入 500 mL 自来水，然后在两侧容器中各加入 250 mL 自来水，中央容器中加入 200 mL 自来水。 
3. 将最多 3 张切片放入一个五孔切片架中。 
4. 用 HIER 缓冲液填充切片架，直至组织完全浸没。注意：确保切片架顶部有一个小孔用于释放蒸汽，防止加压。 
5. 运行“程序 4”，在 95 °C 下持续 20 分钟。 
6. 同时，预热后续步骤所需的孵育室（参见步骤 3.5）
7. 孵育结束后，取出切片架并放入盛有自来水的容器中冷却。 
8. 冷却 5 分钟。 
9. 移除切片架中一半的缓冲液，并用蒸馏水替换。继续冷却 5 分钟。
10. 逐步移除缓冲液并分两次增加水量，每次均冷却 5 分钟。
11. 最后，用 100% 蒸馏水冲洗切片。

3. 封闭非特异性结合

1. 通过将150 µL含10% BSA的TBS加入350 µL含0.1% Triton X-100的TBS中，配制封闭缓冲液（Tris缓冲盐水或TBS，0.1% Triton X-100，3%牛血清白蛋白或BSA）。
   注意：含10% BSA的TBS储存于-20 °C，每次使用前需新鲜解冻。
2. 使用载片盒或Coplin染色缸，用含0.1% Triton X-100的TBS洗涤载片，每次5分钟，共洗两次。
3. 将载片从载片盒中取出，用Kim擦拭纸擦去PAP圈外的任何缓冲液。静置约1分钟使其略微干燥。 
4. 使用P200移液器，在组织上滴加几滴封闭缓冲液，足以覆盖组织即可。PAP线应能防止液体溢出组织区域。
   注意：若缓冲液未被限制在PAP圈内，应重新在组织周围绘制PAP圈，以防止后续抗体损失。 
5. 将载片置于湿盒中，室温孵育1小时。 
   注意：空的移液器吸头盒可作为良好的湿盒使用。确保底部留有少量自来水。 

4. 使用金属偶联抗体进行染色

1. 从 4°C 取出金属偶联抗体，并在 10,000 x G 条件下离心 1 分钟。
2. 在 TBS、0.1% Triton X-100 和 1% BSA 混合液中配制抗体母液的最佳稀释度。
   注意：a) 每种抗体的最佳稀释度必须通过实验确定，这是成像质谱流式实验成功最关键的步骤之一。使用 Excel 表格计算所需体积。由于抗体成本较高，配制量应略多于实际需要量即可，例如，若封闭缓冲液使用了 200 µL，则配制 250 µL 的抗体母液。b) 抗体母液应在每次实验的封闭步骤期间新鲜配制。 
3. 孵育结束后（参见步骤 3.5），从孵育箱中取出载玻片。
4. 将载玻片在 Kimwipe 纸上垂直和水平轻敲，以去除多余的封闭缓冲液。此操作应使组织上保留少量缓冲液，但大部分液体被去除。 
5. 静置约 1 分钟，使其略微干燥。
6. 将载玻片放入 4°C 的湿盒中，使其平衡。
7. 然后，小心地将抗体母液用移液器加至组织上，特别注意液体必须完全限制在 PAP 圈内。 
8. 盖上湿盒，于 4°C 过夜孵育。 
9. 过夜孵育后，从 4°C 取出载玻片，并在 Kimwipe 纸上垂直和水平轻敲，以去除多余的抗体母液。 
10. 将载玻片放入邮寄盒或 Coplin 染色缸中，用含 0.2% Triton X-100 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 5 分钟，重复两次。
11. 然后用 PBS 洗涤载玻片 5 分钟，重复两次。取出载玻片，静置干燥约 1 分钟。

5. DNA 插入结合 

1. 进行DNA嵌入时，将Intercalator-Ir用PBS按1:1000比例稀释。 
2. 小心地将稀释后的嵌入剂滴加到组织上，确保溶液完全限制在PAP圈内。
3. 在用于封闭的湿度孵育盒中，室温孵育30分钟。
4. 随后，将载玻片在Kim擦拭纸上垂直和水平轻拍，以去除多余的Intercalator-Ir染料。 
5. 将载玻片放入邮寄盒或Coplin罐中，用HPLC水洗涤两次，每次5分钟。
6. 扫描前将载玻片在干燥器中干燥5分钟。

6. 图像扫描

1. 进行切片扫描时，使用碳化钨尖头玻璃刻刀在载玻片上轻轻划出四个“X”标记。精确的定位点有助于实现最佳的图像配准。
   注意：切勿过于靠近边缘。
2. 使用平板式文档扫描仪扫描，分辨率不低于1200 dpi 
3. 将该图像尽可能贴近载玻片边缘进行裁剪，并保存至U盘。 
4. 为进行图像共配准，使用滨松NanoZoomer扫描载玻片，并在文件名中包含“Pre_IMC”。 

结果

图 1: 用于质谱流式细胞术成像的组织免疫染色程序的示意图

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 设备 Coplin 罐 带通风孔的塑料 5 滑邮件封套 抗原修复装置（Decloaking chamber） 扫描器 化学品和酶: 二甲苯 200 标准乙醇 HPLC 水 Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER 缓冲液 TBS 含 0.1% Trition X-100 的 TBS 含 10% BSA 的 TBS PBS 系列 含 0.2% Trition X-100 的 PBS