用于质谱流式细胞术成像的组织免疫染色

摘要

该视频描述了用于质谱流式细胞术成像的组织样品的制备。首先对组织进行处理以揭示抗原表位、透化细胞并阻断非特异性抗体结合位点。然后，将组织与金属偶联抗体混合物和核染色剂一起孵育。最后，使用光学扫描仪对处理过的组织样本进行成像。

方案

1. 组织预处理:

对于新鲜冷冻组织:

1. 使用前，将玻璃 Coplin 罐放入 -20°C 冰箱中至少一小时。
2. 从 -80°C 冰箱中取出玻片，并将其放入 -20°C 冰箱的玻璃 Coplin 染色缸中至少 15 分钟。
3. 在通风橱下，使用安瓿切割器打开 16% 多聚甲醛 （PFA） 玻璃安瓿瓶。适当丢弃碎玻璃。
4. 将 10 mL 16% PFA 和 30 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 加入塑料 Coplin 染色缸中。确保 PBS 预冷至 4°C。
5. 将此溶液转移到 4°C 冰箱中至少 15 分钟。
6. 15 分钟后，将装有玻片的玻璃 Coplin 玻璃瓶转移到 4°C 冰箱中 10 分钟。
7. 将载玻片从玻璃瓶转移到装有 4% PFA 冷溶液的塑料 Coplin 瓶中。
8. 用 4% PFA 将玻片放在冰箱内 30 分钟。
9. 在室温 PBS 中冲洗玻片 3 次，每次 5 分钟，确保在循环之间彻底冲洗。

对于 FFPE 组织:

1. 从安装在带正电荷的标准显微镜载玻片上的 5 μm 福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织切片开始。
2. 通过在 60°C 下加热 1 小时来脱蜡玻片。
3. 取出玻片并冷却至室温约 5 分钟。
4. 将玻片放入载玻片邮件中，在二甲苯浴中冲洗 3 分钟，共 2 次。
5. 再次用 100% 乙醇冲洗玻片 1 分钟，共两次。
6. 同样，用 95% 和 70% 乙醇冲洗玻片，各 1 分钟。
7. 最后，在蒸馏水中最后冲洗两次><，每次 3 分钟。 注意:Hyperion 不能在距玻片边缘 2 毫米的范围内消融，尽可能地将组织居中。

2. 热诱导表位修复 （HIER）

1. 制备 Tris-乙二胺四乙酸 （EDTA） pH9 缓冲液:
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER 缓冲液以 100 倍的倍数购买，并稀释至 1 倍于高效液相色谱 （HPLC） 水中。
   2. 例如:将 2.5 mL Abcam ab93684 加入 247.5 mL HPLC 水中。
      注意: 不应使用超过 6 个月的缓冲液。
2. 设置一个去隐蔽室来加热载玻片。首先，用 500 mL 的自来水填充腔室底部。然后，向两个侧容器中加入 250 mL 自来水，向中央容器中加入 200 mL 自来水。
3. 将最多 3 张玻片放入 5 张玻片邮寄袋中。
4. 用 HIER 缓冲液填充载玻片邮件，直到组织完全浸没。注意: 确保载玻片封套顶部有一个小孔，以排出蒸汽并防止加压。
5. 在 95 °C 下运行"程序 4"20 分钟。
6. 同时，预热孵育室以进行后续步骤（请参阅步骤 3.5）
7. 孵育后，取出邮件盒，将其放入装有水龙头冷水的浴缸中。
8. 让它冷却 5 分钟。
9. 从邮件中取出一半的缓冲液，然后用蒸馏水更换。让它冷却 5 分钟。
10. 逐渐去除缓冲液并增加水量两次，每次冷却时间为 5 分钟。
11. 最后，用 100% 蒸馏水冲洗载玻片。

3. 阻止非特异性结合

1. 通过将 150 μL 含 10% BSA 的 TBS 添加到 350 μL 含 0.1% Triton X-10.
   的 TBS 中来制备封闭缓冲液（Tris 缓冲盐水或 TBS、0.1% Triton X-100、3% 牛血清白蛋白或 BSA） 注意: 含有 10% BSA 的 TBS 储存在 -20 °C，每次都应新鲜解冻。
2. 使用玻片邮寄袋或 Coplin 染色缸，在 TBS、0.1% Triton X-100 中洗涤玻片 5 分钟，分两次。
3. 从邮件中取出载玻片，并使用 Kim 擦除去除 PAP 圆圈外的任何缓冲区。让 ~1 分钟稍微干燥。
4. 使用 P200，在组织上滴几滴封闭缓冲液，刚好足以覆盖组织。PAP 管应将液体保持在组织上。
   注意: 如果缓冲液不局限于 PAP 圆圈中，请在组织周围重新绘制 PAP 圆圈，以防止以后抗体丢失。
5. 将玻片在室温下在湿度箱中孵育 1 小时。
   注意:空的移液器吸头盒适用于湿度室。确保底部有少量自来水。

4. 用金属偶联抗体染色

1. 从 4°C 中取出金属偶联抗体，并以 10,000 x G 离心 1 分钟。
2. 在 TBS、0.1% Triton X-100 和 1% BSA 混合物中制备抗体预混液的最佳稀释><度。 注:a） 必须通过实验确定每种抗体的最佳稀释度，这是成功进行质谱流式细胞术实验的最关键步骤之一。使用 Excel 电子表格计算交易量。由于抗体成本，仅略高于所需量。例如，如果需要 200 μL 封闭缓冲液，则制备 250 μL 预混液。b） 在封闭步骤中，应为每个实验准备新鲜的预混液。
3. 孵育后（请参阅步骤 3.5），从培养箱中取出玻片。
4. 通过在 Kim 湿巾上垂直和水平敲击载玻片来去除多余的阻塞缓冲液。这应该会在组织上留下一些封闭缓冲液，但会去除大部分。
5. 让 ~1 分钟稍微干燥。
6. 将玻片放入 4°C 的湿度室中并使其平衡。
7. 然后，小心地将抗体预混液移液到组织上，非常小心地确保溶液包含在 PAP 环内。
8. 关闭湿度室并在 4°C 下孵育过夜。
9. 孵育过夜后，从 4°C 中取出载玻片，并在 Kim 湿巾上垂直和水平敲击载玻片以去除多余的预混液。
10. 将玻片放入邮件或 Coplin 罐中;用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤 5 分钟，补充 0.2% Triton X-100，两次。
11. 然后，在 PBS 中洗涤玻片 5 分钟，共 2 次。取下载玻片并使其干燥约 1 分钟。

5. DNA插层

1. 对于 DNA 嵌入，在 PBS 中以 1:1000 稀释 Intercalator-Ir
。
2. 小心地将稀释的插层剂移液到组织上，要非常小心地确保溶液包含在 PAP 环内。
3. 在室温下在用于封闭的湿度箱中孵育 30 分钟。
4. 之后，在 Kim 湿巾上垂直和水平敲击载玻片以去除多余的 Intercalator-Ir 染料。
5. 将玻片放入邮寄袋或 Coplin 染色缸中，用 HPLC 水洗涤两次，每次 5 分钟。
6. 扫描前，将玻片在干燥器中干燥 5 分钟。

6. 图像扫描

1. 对于玻片扫描，使用硬质合金尖端玻璃蚀刻机在玻片上划伤四个微弱的 X。精确的示教点将允许最佳图像配准。
   注意:不要太靠近边缘。
2. 使用平板文档扫描仪以不小于每英寸 1200 点的速度进行扫描
3. 将此图像尽可能裁剪到幻灯片边框，并将其保存到闪存驱动器中。
4. 对于图像共同配准，请在 Hamamatsu NanoZoomer 上扫描文件名中带有"Pre_IMC"的载玻片。

结果

图 1: 用于质谱流式细胞术成像的组织免疫染色程序的示意图

材料