通过膜片钳方法建立全细胞配置

摘要

来源:Segev， A. et al.， 脑切片中的全细胞膜片钳记录。J. Vis. Exp.（2016 年）

该视频演示了小鼠脑切片中的全细胞膜片钳技术。该技术在微量移液器和神经元膜之间建立了稳定的连接，该连接被进一步破坏以建立全细胞配置，以研究神经元的健康和生理反应。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 切片准备

1. 构建或获得切片回收室。
   注:回收室的原理很简单，可以在实验室中制造（图 1）。简而言之，腔室是一个容器，其中插入了一个篮子，以将脑切片保持在低于人工脑脊液 （aCSF） 表面的水平。
2. 例如，获得四个环（4 - 6 mm 高）（图 1A，侧视图;B，俯视图）通过切割 30 cc 注射器。然后，将拉伸的网（例如，从尼龙软管上剪下来）粘到环的一侧以固定脑切片（图 1B）并将环粘合在一起。
   注意:可以使用胶枪。
   1. 粘合四个环后，将弯曲的等腰梯形塑料壁粘在两个环上（图 1A 和 B），以从恢复的脑切片中转移氧泡（图 1C 和 D）。如图 1D 所示，在与塑料壁相同的一侧插入氧气扩散系统（此处为气体扩散管）。
3. 切片前，充氧 （95% O₂/5% CO₂） 并将切片溶液（参见步骤 1.4）冷却至 0 - 2 °C。
4. 在室温 （RT） 下用标准 aCSF 填充定制回收室。在将切片放入恢复室之前，确保 aCSF 氧合良好（20 - 30 分钟，时间可能因腔室体积而异）。确保气泡不会直接接触切片或破坏切片。
5. 在振动切片机冰盘上铺上冰块，并注入冷水，以便浸没切片室的三分之一到二分之一。小心地将氧气输送系统（例如气体扩散石）和温度探头放入切片室中，这样任何物品都不会干扰刀片移动或切片作。
6. 准备提取大脑和解剖所需大脑区域所需的解剖区域和工具。
   注意:执行的确切解剖将取决于所研究的特定大脑区域，因为不同的大脑结构需要在不同的平面（例如，冠状、矢状或水平切片）进行切片。
   1. 将以下工具放在垫子上:斩首剪刀、手术刀、小直尖剪刀、血管插管钳（或任何宽尖手术工具，如咬合器，更适合大鼠头骨）、弯曲止血钳、镊子、抹刀、舀铲、滤纸、培养皿、单边剃须刀片和氰基丙烯酸酯胶。
7. 当温度达到 0-2°C 时，将切片溶液转移到切片室（缓冲托盘）中。
8. 使用异氟醚在干燥室中麻醉小鼠。确切的量可能会根据所用腔室的大小而有所不同，但对于一个小的鞋盒笼，请使用几滴 （~3-4）。将鼠标留在笼子中，直到变得不动（对触觉刺激没有反应;对于此处描述的条件，大约 15 秒）。进行尾巴和足部捏试验，确保动物被深度麻醉，然后在心脏停止跳动之前斩首（增强细胞活力><）。 注:在有适当理由的情况下，一些实验室获得了进行活体斩首的授权，以尽可能减少兴奋性毒性过程并提高细胞活力。
9. 执行解剖。
   注意:必须快速提取大脑（<45 秒）。
   1. 使用手术刀从头骨到尾部切割颅骨顶部的浅表皮肤。
   2. 剥掉头部两侧的头皮。
   3. 使用小直尖剪刀，沿 lambdoid 缝合线剪断顶板以去除小脑。去除枕骨。
   4. 使用相同的剪刀，剪断矢状缝合线。
   5. 将血管插管钳（如果打破大鼠头骨，则滑入 rongeurs）滑到每个顶骨下方并拉动以露出大脑。
   6. 使用弯曲的止血钳，捏住额骨使其断裂，然后使用镊子或血管插管钳去除骨折。尽可能轻柔地切割和去除硬脑膜，因为它会干扰解剖。
   7. 将刮刀滑到大脑下方，然后轻轻地将其从颅骨中拉出。将其放入先前装满冰冷 aCSF 的切片室（缓冲盘）中。让大脑冷却 1-2 分钟。
   8. 通过在培养皿中加入冰和一些冰水来准备解剖平台，以允许更多的表面接触。用盖子盖住培养皿，将滤纸放在上面。用冷 aCSF 润湿滤纸。
   9. 一旦大脑冷却下来，将大脑放在装满冰的培养皿上，并迅速进行适当的解剖以获得所需的切片平面。
   10. 为了获得含有伏隔核 （NAc） 的矢状切片，请使用单刃剃须刀片切割并去除嗅结节和小脑（如果它们仍然存在）。然后，从右半球的外侧边界进行 2-3 mm 的矢状切割，以获得将粘合在标本固定板上的平坦表面（参见步骤 1.8.11><）。 注意:仅从半球的外侧边界切割 2 - 3 毫米，将允许从两个半球收集含有 NAc 的切片。适当的解剖将取决于所研究的大脑区域。在这里，进行解剖，以便将 NAc 神经元记录在矢状脑切片中。
   11. 根据所需的切片平面，将大脑的平坦切割表面快速粘合（使用涂在标本固定板上的氰基丙烯酸酯胶）到板上。要获得矢状脑切片，请参见步骤 1.8.10。
   12. 立即将标本固定板放入切片室中，以便将大脑从头尾切片（为安全起见，只有在固定标本板时才设置刀架）。
   13. 使用适当的切片参数设置振动切片机（材料中提到的振动切片机实验室中使用的参数:速度 3 - 4，振动 9-10 和切片厚度 250 μm）。
   14. 切片后，使用塑料修剪的移液管将脑切片转移到恢复室（在 RT 处）（参见步骤 1.3）。恢复时间可能因所研究的神经元类型而异（通常为 30 - 90 分钟）。

2. 记录微量移液器和钻机准备

1. 请参阅拉拔器用户手册的具体指南，以获得所需的微量移液器特性。
   注:对于 MSN，我们使用 3.2-4.0 MΩ 的移液器电阻范围。
2. 给 aCSF 充氧并将流量调节至 2 ml/min。使用安装在设施中的蠕动泵或真空管路对 aCSF 进行真空。
3. 打开灌注加热器控制器并调整温度设置以获得所需的温度（例如，31.8-32.2 °C）。
   注:温度稳定性取决于腔室中具有恒定的 aCSF 水平和恒定的流速。由于神经元的几种生物物理特性（例如，输入电阻 R_i，也称为膜电阻，R_m）对温度敏感，因此保持稳定的温度很重要。
4. 打开计算机控制的放大器、摄像头、显微作器和显微镜背景灯。如果执行需要对组织进行电刺激的实验，请打开刺激控制器和隔离装置。
   注意: 其他制造商的一些 amp升压器建议在使用前进行"预热"，因此建议查阅手册以了解确切的作程序。
5. 启动相机捕获、信号采集和放大器软件。
6. 切片放置和可视化:
   1. 使用塑料修剪头移液管，从回收室中轻轻吸取一个脑切片。
   2. 将移液管放入记录室中，轻轻地将移液管中的切片挤出到记录室底部的盖玻片上。
      注意:只要没有发生溢流，从回收室中溢出一些 aCSF 到浴槽中是无害的。
   3. 使用镊子改变切片的位置，以便将所需区域正好放置在记录室的中心。使用显微镜低倍 （4X） 物镜和目镜帮助定位。
   4. 达到所需位置后，在腔室中使用切片压紧装置（也称为"竖琴"）固定脑切片位置。
   5. 切换到高功率 （40X） 物镜并轻轻降低，直到与腔室中的 aCSF 接触。
   6. 使用微调轮聚焦组织。与 aCSF 接触时，请勿使用显微镜上的粗调轮，因为过度降低物镜会压碎切片，甚至破坏腔室底部的盖玻片，这会导致 aCSF 溅到聚光镜上并损坏它。
   7. 当焦点在组织水平上时，观察目标区域中的细胞形状。死细胞很容易通过其膨胀的质膜和细胞核来识别（图 1E）。健康细胞应表现为圆形、卵形或椭圆形均质结构（图 1E）。
   8. 查找目标单元格。在计算机屏幕上标记它，以帮助指导记录微量移液器。如果使用 QCapture 等软件，请按住鼠标左键在目标单元格周围绘制一个正方形。
   9. 抬起物镜，使物镜与 aCSF 接触形成的锥体中有足够的空间来放置和移动记录微量移液器。
7. 微量移液器的放置和定位
   1. 使用 1 ml 注射器、非金属微量注射器针头和专用过滤器，用根据计划实验预先制备的内部溶液（基于 K ⁺ 或基于 Cs ⁺ 的内部溶液，参见成分材料）填充微量移液器。使用足够的溶液，使内部溶液与微量移液器支架内的氯化物涂层银丝电极接触。
      注意:银丝电极可以通过将其浸泡在家用漂白剂中来氯化。核苷三磷酸（腺苷三磷酸，ATP和鸟苷三磷酸，GTP）可以在使用前添加到内部溶液中。将含有溶液的注射器放在冰上，以防止 ATP/GTP 降解。
   2. 确保微量移液器中没有气泡，因为当微量移液器在组织中时，它们可能会出来并遮挡切片。
   3. 将微量移液器放入电极支架中，使溶液与涂有氯化银的导线电极接触。
   4. 拧紧移液器盖，使锥形垫圈在微量移液器周围形成密封。
   5. 在将微量移液器浸入 aCSF 中之前，施加正压，以防止碎屑进入移液器。
   6. 将头台置于锁定位置（面向腔室），并使用显微纵器将其向下引导至腔室，使其大致位于浸没物镜的中心下方。
   7. 在使用显微作器（设置为中高速）移动微量移液器的同时，使用计算机屏幕定位微量移液器并将其引导至 X-Y 轴上的细胞位置。
   8. 通过施加电压步长（例如，4 mV 持续 100 毫秒）来测量微量移液器电阻，这可以通过特定软件手动或通过自动完成，例如如果使用 Clampex 软件中的"膜测试"，则为"浴"模式（另见步骤 4）。为了确保没有气泡或任何其他异物堵塞微量移液器，请使用通过聚乙烯管连接到微量移液器支架的充气注射器（例如，30 cc 注射器）施加正压。
   9. 清除微量移液器后，执行电压偏移以将移液器电流降低到零，这可以手动或通过特定软件完成，例如计算机控制放大器 commander.
      注意:此功能将补偿由浴槽和微量移液器溶液之间的浓度差异（即液接电位）引起的任何电压。

3. 膜测试

注意:此步骤适用于素材中提到的放大器。

1. 使用计算机控制的放大器指令器时，请始终将其设置为电压钳模式以执行膜测试。
   注意:当膜测试设置为"浴"模式时，膜测试允许测量微量移液器的阻力和形成密封时的密封阻力。
2. 一旦膜破裂（参见步骤 4.8），将膜测试切换到"细胞"模式，以便获得串联电阻 （R_s）（也称为访问电阻，RA）、R_i 和膜电容 （CP）。

4. 最终方法，密封形成，获得全细胞构型

1. 使用精细对焦轮，开始向下对焦，同时逐渐降低微量移液器。始终先向下对焦，然后将微量移液器向下降低到对焦平面。这将确保微量移液器吸头不会突然渗入切片。
2. 当微量移液器接触到切片表面时，将显微作器的速度减慢至中低模式。
3. 使用连接到移液器支架的充气注射器轻轻施加轻微的正压，以清除进路中的任何碎屑。
4. 通过与 X-Y-Z 控制旋钮交替接近，或者通过对角线接近（如果显微纵器模型允许），其中两个 X-Z 轴都随着 Z 轴旋钮的旋转而改变。后一种方法将防止组织垂直受压。
   注意:这里的目标是通过对切片造成最小的损伤来接近细胞。当微量移液器足够靠近细胞时，会出现一个凹坑（由通过微量移液器尖端施加的正压引起的细胞表面的圆形变色）（图 2）。
5. 当出现酒窝时（图 2-1），通过连接到移液器支架吸管的管子进行微弱而短暂的抽吸，以形成密封（图 2-2）。持续监测膜测试.
   注意:如果形成部分密封 （<1 GΩ），则通过降低保持电位（在计算机控制的放大器指令器上）注入负电流可以促进密封的形成并达到千兆级电阻（"千兆级密封"或"千兆级密封" >1 - 5 GΩ）。密封件的高电阻 （>1 GΩ） 既可以限制噪声对录制信号的污染，又有助于贴片的机械稳定性。
6. 当 gigaseal 形成时，使用计算机控制的放大器指令器使细胞的保持电位尽可能接近生理静息电位 （V_rest），以防止膜破裂后突然变化。例如，MSN 的电压钳位通常为 -70 或 -80 mV（生理 V_静息:-70 至 -90 mV）。
7. gigaseal 形成后，手动或自动补偿快速和慢速电容。如果使用计算机控制的放大器指令器，例如 Multiclamp 指令器，请按 'Auto' 选择 'Cp Fast' 和 'Cp Slow"。
8. 如果密封保持稳定且高于 1 GΩ（或注入小于 10 - 20 pA 以将细胞保持在所需的膜电位），则通过与 4.5 相同的试管进行短暂而强烈的抽吸以破坏质膜（图 2-3><）。 注意:这可能需要多次试验。当抽吸足够强烈时，可以实现良好的膜破裂，以便破裂的膜不会堵塞微量移液器（这可能导致记录过程中 R_s 的增加），但足够弱，以便不会吸入大部分膜或细胞。
9. 在成功实现全细胞配置后，定期监测微量移液器位置以评估和纠正显着漂移，因为这可能导致贴剂丢失。漂移幅度可能因多种因素而异，例如，钻机安装的质量和头部的拉力。理想情况下，漂移应该几乎不存在。
10. 通过在膜测试中切换到"细胞"模式，查看细胞的不同参数，例如 R_i、R_s 和 C_p。在录制过程中监视这些参数。
    注:所有这些参数都有助于评估细胞和细胞类型的初始健康状况（参见"膜测试"部分，第 4 步）。

结果

图 1.定制的恢复室 （A-D） 和一张 400 倍脑切片的照片，显示健康和死亡的神经元 （E）。A-D） 制作自定义恢复室的程序在步骤 2.1 中描述。E） 脑切片中 400 倍的 NAc 内侧壳 MSN 的图片，显示了健康（红色箭头）与死亡神经元（蓝色箭头）的示例。请注意，尽管某些细胞显示为健康，但它们的球形表示它们可能不如预期健康（带星号的红色箭头）。在实现全细胞配置后，根据 V_rest和 R_i 评估最终健康状况。

图 2.描述获得 ...

材料