通过膜片钳方法建立全细胞记录构型

摘要

来源：Segev, A. 等，脑片中的全细胞膜片钳记录。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在小鼠脑切片中进行全细胞膜片钳技术的操作。该技术首先在微电极与神经元膜之间建立稳定连接，随后进一步破坏膜结构，形成全细胞构型，以研究神经元的健康状况及生理反应。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 切片制备

1. 构建或获取一个切片恢复室。
   注意：恢复室的原理很简单，可以在实验室中自行制备（图1）。简而言之，该灌流室是一个容器，内置一个篮状结构，用于放置脑切片，使其位置低于人工脑脊液（aCSF）的液面。
2. 例如，取四个环（高 4 - 6 mm）（图1A，侧面视图； B，俯视图）通过切割一个30毫升注射器制备。然后，将拉伸的网膜（例如，从尼龙软管上剪下）固定在环的一侧，用于固定脑切片（图 1B）并将环状物相互粘合。
   注意可以使用热熔胶枪。
   1. 将四个环粘合后，将一个呈弯曲等腰梯形的塑料壁粘接到其中两个环上（图1A 和 B) 以使氧气气泡从正在恢复的脑片中偏转图1C 和 D）。如图所示 图1D在靠近塑料壁的同一侧插入一个氧气扩散系统（此处为气体分散管）。
3. 切片前，用含氧（95% O₂）气体饱和的溶液进行预处理。₂/5% CO₂₂并将切片液（见步骤1.4）冷却至0 - 2 °C。
4. 将定制的恢复室中加入室温（RT）的标准aCSF。在放入脑片前，确保aCSF充分氧合（20–30分钟，时间可根据恢复室体积调整）。确保气体气泡不直接接触脑片或对其造成扰动。
5. 用冰填满振动切片机的冰盘，并加入冷水，使切片室的三分之一至一半浸没在水中。小心放置氧气输送系统（例如，气体弥散石）以及温度探头置于切片室中，确保二者均不干扰刀片运动或切片操作。
6. 准备解剖脑组织及分离目标脑区所需的解剖区域和工具。
   注意：具体进行的解剖操作将取决于所研究的脑区，因为不同的脑结构需要在不同的平面上进行切片例如，冠状面、矢状面或水平面切片）。
   1. 将以下工具放置于垫巾上：断头剪、手术刀、小型直头尖头剪、血管插管镊（或任何尖端较宽的外科工具，如咬骨钳，更适合大鼠颅骨）、弯头止血钳、镊子、刮勺、挖勺、滤纸、培养皿、单刃剃刀刀片及氰基丙烯酸酯胶。
7. 当温度降至0-2°C时，将切片液转移至切片室（缓冲托盘）中。
8. 在干燥器密闭室中使用异氟烷对小鼠进行麻醉。异氟烷用量可能因密闭室大小而异，对于小型鞋盒式笼具，使用几滴（约3–4滴）即可。将小鼠置于笼内直至其失去运动能力（对触觉刺激无反应，约15秒，根据此处所述条件）。通过尾部和足部夹捏测试确认动物已处于深度麻醉状态，随后在心脏停搏前实施断头（有助于提高细胞活性）。
   注意在合理论证的前提下，一些实验室获得授权进行活体断头，以最大程度减少兴奋性毒性过程并提高细胞存活率。
9. 进行解剖操作。
   注意：必须迅速取出大脑（<45 秒。
   1. 使用手术刀从颅骨前端至后端切开颅骨表面的皮肤。
   2. 剥离头两侧的头皮。
   3. 使用小型直头锐尖剪刀，沿人字缝剪开顶间骨以移除小脑。去除枕骨。
   4. 使用同一把剪刀，剪开矢状缝。
   5. 将血管插管镊子（或咬骨钳，若为大鼠颅骨）滑至每侧顶骨下方，牵拉以暴露脑组织。
   6. 使用弯止血钳夹住额骨以将其折断，然后用镊子或血管插管钳移除碎骨。尽可能轻柔地剪开并去除硬脑膜，因其可能干扰解剖操作。
   7. 用解剖刀从脑下方滑入，轻轻将其从颅骨中取出。放入预先盛有冰冻人工脑脊液（aCSF）的切片室（缓冲槽）中。让脑组织冷却1-2分钟。
   8. 用冰和一些冰水填充培养皿以制备解剖平台，确保更大的表面接触。盖上培养皿盖子，并在上方放置滤纸。用冷的aCSF浸湿滤纸。
   9. 待脑组织冷却后，将其置于盛有冰的培养皿中，并迅速进行相应解剖以获得所需的切片平面。
   10. 为获取包含伏隔核（NAc）的矢状切片，使用单刃剃须刀片切除并移除嗅结节和小脑（若仍存在）。随后，从右半脑外侧缘向内进行2-3 mm的矢状切割，以获得可用于粘附于标本固定板上的平整切面（参见步骤1.8.11）。
       注意：仅从半球外侧边缘切割2-3 mm，即可收集到包含双侧伏隔核（NAc）的脑片。具体的解剖方式取决于所研究的脑区。此处的解剖操作旨在获取可用于记录NAc神经元活动的矢状脑切片。
   11. 用氰基丙烯酸酯胶水将脑组织的平面切面快速粘附到标本固定板上，确保粘贴方向符合预期的切片平面。如需获取矢状面脑切片，请参见步骤 1.8.10。
   12. 立即将样本固定板放入切片室并固定，使脑组织进行头-尾方向切片（为安全起见，仅在样本板固定后安装刀片架）。
   13. 设置振动切片机的适当切片参数（本实验所用材料中提及的振动切片机在实验室中的参数设置为：速度 3–4，振动强度 9–10，切片厚度 250 µm）。
   14. 切片后，使用塑料包被的移液管将脑片转移至恢复室（室温）（参见步骤1.3）。恢复时间可能因所研究的神经元类型而异（通常为30–90分钟）。

2. 记录微电极和仪器准备

1. 参考拉制仪用户手册中的具体指南，以获得所需的微电极特性。
   注意：对于MSN，我们使用的移液管电阻范围为3.2-4.0 MΩ。
2. 用蠕动泵或实验室内安装的真空管线对人工脑脊液（aCSF）进行氧合，并将流速调节至2 ml/min。
3. 打开灌流加热控制器，并调节温度设置以达到所需温度（例如，31.8-32.2 °C。
   注意：温度稳定性取决于灌流 chamber 中 aCSF 液面高度和流速的恒定。由于神经元的多种生物物理特性（例如，输入电阻，R_i，也称为膜电阻，R_m温度敏感，因此保持稳定的温度至关重要。
4. 打开计算机控制的放大器、相机、显微操作器和显微镜背景光源。如果进行需要对组织施加电刺激的实验，请打开刺激控制器和隔离单元。
   注意一些其他厂商的放大器建议在使用前进行“预热”，因此建议查阅说明书以了解确切的操作步骤。
5. 启动相机采集、信号采集和放大器软件。
6. 切片放置与可视化：
   1. 使用塑料修尖的移液管，从恢复室中轻轻吸取一个脑切片。
   2. 将移液管放入记录室中，轻轻挤压，使切片从移液管中缓慢释放并置于 chamber 底部的盖玻片上。
      注意只要没有发生溢出，回收室中的部分aCSF流入浴槽是无害的。
   3. 使用镊子调整切片位置，使目标区域精确置于记录室中央。借助显微镜低倍（4X）物镜和目镜辅助定位。
   4. 当达到理想位置后，使用切片固定装置（也称为“harp”）在记录 chamber 中固定脑片位置。
   5. 切换至高倍（40X）物镜，并缓慢降低物镜，直至其与腔室中的aCSF接触。
   6. 使用微调旋钮将组织调至清晰对焦。当组织处于aCSF接触状态下时，切勿使用显微镜的粗调旋钮，因为过度降低物镜可能会压碎脑片，甚至损坏培养皿底部的盖玻片衬层，导致aCSF溢出并污染聚光镜，造成损坏。
   7. 当聚焦于组织层面时，观察目标区域细胞的形态。死亡细胞因其肿胀的细胞膜和细胞核而易于识别。图1E）。健康的细胞应呈现为圆形、卵圆形或椭圆形的均质结构（图1E).
   8. 寻找目标细胞。在计算机屏幕上标记该细胞，以帮助引导记录用微电极。如果使用 QCapture 等软件，按住鼠标左键在目标细胞周围绘制一个方框。
   9. 抬高物镜，以便在物镜与人工脑脊液（aCSF）接触形成的锥形空间内留出足够间隙，用于放置和移动记录微电极。
7. 微量移液管的放置与定位
   1. 使用1 ml注射器、非金属微量注射针和专用滤器，将预先根据实验计划配制的内液（K⁺-基或Cs⁺基于的内液，参见 材料 确保溶液用量充足，使内液与微移液管夹持器内涂有氯化物的银丝电极接触。
      ​注意：将银丝电极浸泡在家用漂白剂中可使其氯化。核苷三磷酸（三磷酸腺苷，ATP & 三磷酸鸟苷（GTP）可在使用前添加至内液中。将装有溶液的注射器置于冰上，以防止ATP/GTP降解。
   2. 确保微量移液器中无气泡，因为气泡可能在移液器插入组织时逸出，从而遮挡切片。
   3. 将微量移液器放入电极架中，使溶液与涂有氯化银的金属丝电极接触。
   4. 拧紧移液器盖子，使锥形垫圈在微量移液器周围形成密封。
   5. 在将微移液管浸入aCSF之前施加正压，以防止碎屑进入移液管。
   6. 将头架置于锁定位置（朝向记录室），并使用显微操作器将其向下引导至记录室附近，大致位于浸没式物镜中心下方。
   7. 移动显微注射仪（设定为中高速）时，通过计算机屏幕定位显微移液管，并引导其沿X-Y轴方向移向细胞所在位置。
   8. 通过施加电压阶跃来测量微量移液管的电阻例如，4 mV 持续 100 毫秒），可通过手动操作或使用特定软件自动完成，例如在 Clampex 软件中使用“Membrane Test”的“bath”模式（另见步骤4）。为确保无气泡或其他异物堵塞微电极，应使用充满空气的注射器施加正压例如，30 cc 注射器）通过聚乙烯管连接至微移液管架。
   9. 清除微移液管后，进行电压调零以将移液管电流降至零，可通过手动方式或通过计算机控制的放大器指令软件（如“pipette offset”）完成。
      注意：该功能将补偿由于浴液与微电极溶液之间浓度差异所引起的任何电压即，液接电位。

3. 膜测试

注意：此步骤适用于材料部分提到的扩增仪。

1. 使用计算机控制的放大器控制器时，始终将其设置为电压钳模式以执行膜测试。
   注意：当膜测试设置为“Bath”模式时，可在封接形成后测量微电极阻抗和封接电阻。
2. 一旦细胞膜破裂（见步骤 4.8），将膜测试切换至“Cell”模式，以获取串联电阻（R_s，也称为通路电阻 R_a）、R_i 和膜电容（C_p）。

4. 最终接近、封接形成及全细胞记录模式的获取

1. 使用细调焦旋钮，一边逐渐降低微量移液管，一边开始向下聚焦。务必先向下聚焦，再将微量移液管降至焦平面。这样可确保微量移液管尖端不会突然刺入脑片。
2. 当微量移液管接触到脑片表面时，将显微操作器的速度调至中低档。
3. 使用连接至移液管夹持器的充气注射器，轻轻施加微弱的正压，以清除进路中的任何碎屑。
4. 通过交替调节X-Y-Z控制旋钮，或（若显微操作器型号允许）采用对角线方式接近细胞，即旋转Z轴旋钮的同时改变X和Z轴位置。后一种方法可避免组织受到垂直压缩。
   注意：此处的目标是以对脑片造成最小损伤的方式接近细胞。当微量移液管足够接近细胞时，会出现一个凹陷（由于通过移液管尖端施加正压而在细胞表面形成的圆形变色区域）（图2）。
5. 当出现凹陷时（图2-1），通过连接至移液管夹持器吸管的管道施加短暂而微弱的负压，以形成封接（图2-2）。持续监测膜测试结果。
   注意：若已形成部分封接（<1 GΩ），可通过降低钳制电位（在计算机控制的放大器指令器上操作）注入负向电流，从而促进封接形成并达到千兆欧姆级电阻（“千兆欧姆封接”或“gigaseal”，>1 - 5 GΩ）。高阻封接（>1 GΩ）既能限制记录信号中的噪声干扰，也有助于提高膜片钳的机械稳定性。
6. 在形成千兆欧姆封接的过程中，使用计算机控制的放大器指令器将细胞的钳制电位尽可能调节至接近生理静息电位（V_rest），以防止膜破裂后发生电位突变。例如，中等棘状神经元（MSNs）通常被电压钳制在-70或-80 mV（生理静息电位V_rest为-70至-90 mV）。
7. 在千兆欧姆封接形成后，手动或自动补偿快速和慢速电容。若使用Multiclamp指令器等计算机控制的放大器指令器，可按下“Cp Fast”和“Cp Slow”的“Auto”按钮进行自动补偿。
8. 若封接保持稳定且电阻高于1 GΩ（或为将细胞维持在目标膜电位所需注入的电流小于10 - 20 pA），则通过与步骤4.5相同的管道施加短暂而强烈的负压，以破裂细胞膜（图2-3）。
   注意：此过程可能需要多次尝试。理想的细胞膜破裂应施加足够强的负压，使破裂的膜不会堵塞移液管尖端（否则可能导致记录过程中串联电阻R_s升高），但又不能过强，以免吸入大量膜结构或整个细胞。
9. 成功建立全细胞记录构型后，应定期监测微量移液管的位置，评估并校正明显的漂移，以防丢失记录。漂移幅度可能受多种因素影响，e.g.，记录装置安装质量及对前置放大器头段的牵拉力。理想情况下，漂移应几乎不可察觉。
10. 在膜测试界面切换至“Cell”模式，可查看细胞的多种参数，如输入电阻R_i、串联电阻R_s和膜电容C_p。在记录过程中持续监测这些参数。
    注意：这些参数有助于评估细胞的初始健康状态及细胞类型（参见“膜测试”部分，步骤4）。

结果

图1. 自制恢复室（A-D）及400倍镜下脑切片图像，显示健康与死亡神经元（E）。A-D） 定制回收室的制作步骤见第2.1步。 E) 400倍镜下脑切片中NAc内侧壳MSNs的图像，显示健康细胞示例（红色箭头） 与 死亡的神经元（蓝色箭头）。注意，尽管某些细胞被标记为健康，但其呈球形的形态表明它们可能并非处于理想健康状态（带星号的红色箭头）。最终的健康状态评估依据 V_休息 和 R_i 形成全细胞构型后。 <...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
独立脉冲刺激发生器	A.M.P.I	Master-8
隔离单元（ISO-Flex）	A.M.P.I	ISO-Flex
计算机控制放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
数字采集系统	Molecular Devices	Digidata 1500
显微镜	Olympus	BX-51
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-200
灌流室及在线加热器	Warner Instruments	TC-344B
振动切片机	Leica	VT1000 S
微电极拉制仪	Narishige	PC-10
成像相机	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige 微电极拉制仪 PC-10	Narishige	PC-10
玻璃毛细管	WPI	TW150F-3
切片固定装置（琴弦式）	Warner Instruments	64-0255
切片灌流室	Warner Instruments	RC-26
非金属注射器针头	World Precision Instruments	MF28G67-5
注射器滤器	Nalgene	176-0045
热熔胶枪	Home Depot	various
气体分散管	Ace Glass Inc.	various
断头剪刀	Home Depot	100649198
3号手术刀柄	World Precision Instruments	500236
小型直头尖头剪刀	World Precision Instruments	14218
血管插管镊	World Precision Instruments	500453
弯头止血镊	World Precision Instruments	501288
经济型镊子 #3	World Precision Instruments	501976-6
刮勺	Fisher Scientific	14357Q
挖取式刮勺	Fisher Scientific	14-357Q
培养皿	Fisher Scientific	08-747B
滤纸	Lab Depot	CFP1-110
溶液
K-葡萄糖酸盐内液（pH 7.2–7.3，280–290 mOsm）
K D-葡萄糖酸盐，120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl，20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES，10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA，0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl₂	Sigma Aldrich/various	M8266
Na₂GTP，0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP，2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
标准人工脑脊液（ACSF，渗透压 ≈ 300–310 mOsm）
KCl，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl，119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH₂PO₄·H₂O，1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO₃，26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
葡萄糖，11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO₄·7H₂O，1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl₂·2H₂O，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
配制溶液所用的其他化合物
KOH	various
犬尿酸	Sigma Aldrich/various	K3375