通过膜片钳方法建立全细胞记录构型

摘要

来源：Segev, A. 等，脑片中的全细胞膜片钳记录。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在小鼠脑切片中进行全细胞膜片钳技术的操作。该技术首先在微电极与神经元膜之间建立稳定连接，随后进一步破坏膜结构，形成全细胞构型，以研究神经元的健康状况及生理反应。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 切片制备

1. 构建或获取一个切片恢复室。
   注意：恢复室的原理很简单，可以在实验室中自行制备（图1）。简而言之，该灌流室是一个容器，内置一个篮状结构，用于放置脑切片，使其位置低于人工脑脊液（aCSF）的液面。
2. 例如，取四个环（高 4 - 6 mm）（图1A，侧面视图； B，俯视图）通过切割一个30毫升注射器制备。然后，将拉伸的网膜（例如，从尼龙软管上剪下）固定在环的一侧，用于固定脑切片（图 1B）并将环状物相互粘合。
   注意可以使用热熔胶枪。
   1. 将四个环粘合后，将一个呈弯曲等腰梯形的塑料壁粘接到其中两个环上（图1A 和 B) 以使氧气气泡从正在恢复的脑片中偏转图1C 和 D）。如图所示 ....

结果

图1. 自制恢复室（A-D）及400倍镜下脑切片图像，显示健康与死亡神经元（E）。A-D） 定制回收室的制作步骤见第2.1步。 E) 400倍镜下脑切片中NAc内侧壳MSNs的图像，显示健康细胞示例（红色箭头） 与 死亡的神经元（蓝色箭头）。注意，尽管某些细胞被标记为健康，但其呈球形的形态表明它们可能并非处于理想健康状态（带星号的红色箭头）。最终的健康状态评估依据 V_休息 和 R_i 形成全细胞构型后。 <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
独立脉冲刺激发生器	A.M.P.I	Master-8
隔离单元（ISO-Flex）	A.M.P.I	ISO-Flex
计算机控制放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
数字采集系统	Molecular Devices	Digidata 1500
显微镜	Olympus	BX-51
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-200
灌流室及在线加热器	Warner Instruments	TC-344B
振动切片机	Leica	VT1000 S
微电极拉制仪	Narishige	PC-10
成像相机	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige 微电极拉制仪 PC-10	Narishige	PC-10
玻璃毛细管	WPI	TW150F-3
切片固定装置（琴弦式）	Warner Instruments	64-0255
切片灌流室	Warner Instruments	RC-26
非金属注射器针头	World Precision Instruments	MF28G67-5
注射器滤器	Nalgene	176-0045
热熔胶枪	Home Depot	various
气体分散管	Ace Glass Inc.	various
断头剪刀	Home Depot	100649198
3号手术刀柄	World Precision Instruments	500236
小型直头尖头剪刀	World Precision Instruments	14218
血管插管镊	World Precision Instruments	500453
弯头止血镊	World Precision Instruments	501288
经济型镊子 #3	World Precision Instruments	501976-6
刮勺	Fisher Scientific	14357Q
挖取式刮勺	Fisher Scientific	14-357Q
培养皿	Fisher Scientific	08-747B
滤纸	Lab Depot	CFP1-110
溶液
K-葡萄糖酸盐内液（pH 7.2–7.3，280–290 mOsm）
K D-葡萄糖酸盐，120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl，20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES，10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA，0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl₂	Sigma Aldrich/various	M8266
Na₂GTP，0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP，2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
标准人工脑脊液（ACSF，渗透压 ≈ 300–310 mOsm）
KCl，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl，119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH₂PO₄·H₂O，1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO₃，26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
葡萄糖，11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO₄·7H₂O，1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl₂·2H₂O，2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
配制溶液所用的其他化合物
KOH	various
犬尿酸	Sigma Aldrich/various	K3375