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1. 在6孔MEA和玻璃盖玻片上将 rtTA/Ngn2阳性hiPSCs分化为神经元
注意： 在本方案中，提供了用于分化的详细步骤 反向四环素调控型转录激活因子（reverse tetracycline-controlled transactivator,rtTA神经原性基因2（Neurogenin-2）Ngn2阳性 hiPSCs 上 6孔微电极阵列（MEA）（由6个独立孔组成，每孔包含9个记录微电极和1个参考微电极）
- 准备多电极阵列（第0天和第1天）
- 在开始分化前一天，根据制造商的建议对多电极阵列（MEA）进行灭菌处理。
- 将黏附蛋白聚-L-鸟氨酸（PLO）用无菌超纯水稀释至终浓度为50 µg/mL。通过在每个孔中加入100 µL稀释后的PLO溶液，覆盖6孔MEA的活性电极区域。
- 将6孔MEA置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜（O/N）培养。次日，吸除稀释的PLO溶液，并用无菌超纯水清洗6孔MEA的玻璃表面两次。
- 将层粘连蛋白（laminin）用冷的Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）稀释至终浓度为20 µg/mL。立即在每个孔中加入100 µL该稀释液，覆盖6孔MEA的活性电极区域。
- 将6孔MEA置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中培养至少2小时 。
- 接种hiPSCs（第1天）
注意： 步骤1.2.1至1.2.4中提到的体积假设 rtTA/Ngn2-阳性hiPSCs在6孔板中培养，并且收获一个孔的细胞。接种到6孔MEA上的细胞所需体积取决于实验中使用的6孔MEA数量；步骤1.2.6至1.2.8中指定的数值允许根据不同的实验规模进行调整。
- 将DMEM/F12、细胞解离液（CDS）和含1%（v/v）青霉素/链霉素的E8培养基恢复至室温（R/T）。向E8培养基中加入强力霉素至终浓度为4 µg/mL，并加入rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。
- 吸除 rtTA/Ngn2-阳性hiPSCs的旧培养基，加入1 mL细胞解离液（CDS）。在含5% CO2的湿润37 °C培养箱中孵育3–5分钟。在显微镜下检查细胞是否彼此分离。
- 向孔中加入2 mL DMEM/F12，用1,000 µL移液器轻轻悬浮细胞，并将细胞转移至15 mL离心管中。向细胞悬液中再加入7 mL DMEM/F12。以200 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，加入2 mL已准备好的E8培养基。用1,000 µL移液器的枪头抵住15 mL离心管内壁，轻轻吹打重悬细胞以解离细胞团块。在显微镜下检查细胞是否已充分解离。
- 使用血细胞计数板测定细胞浓度（细胞/mL）。
注意： 通常一个80–90%汇合度的6孔板单孔可收获约3.0–4.0 × 106 个细胞。
- 吸除稀释的层粘连蛋白溶液。对于6孔MEA，将细胞稀释成浓度为7.5 × 105 个细胞/mL的细胞悬液。在每个6孔MEA孔的活性电极区域加入100 µL细胞悬液进行接种。
- 将6孔MEA置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中培养2小时 。
- 2小时后，小心地向每个6孔MEA孔中加入500 µL已准备好的E8培养基。将6孔MEA置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜（O/N）培养。
- 更换培养基（第2天）
- 次日，配制含1%（v/v）N-2补充剂、1%（v/v）非必需氨基酸和1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基。加入人重组神经营养因子-3（NT-3）至终浓度10 ng/mL，人重组脑源性神经营养因子（BDNF）至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。将培养基预热至37 °C。
- 向上述培养基中加入层粘连蛋白至终浓度0.2 µg/mL。过滤所得培养基。吸除6孔MEA和24孔板各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜（O/N）培养。
- 添加大鼠星形胶质细胞（第3天）
注意： 本方案中提及的体积假设大鼠星形胶质细胞在T75培养瓶中培养。所添加的大鼠星形胶质细胞质量必须良好。我们采用两个标准评估其质量：第一，从大鼠胚胎脑组织分离后，星形胶质细胞应在十天内能够生长至完全汇合；第二，传代后，星形胶质细胞应能形成完整、呈镶嵌状的单层结构。若星形胶质细胞培养物不符合这两个标准，建议不要用于分化实验。
- 将0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）恢复至室温（RT）。将Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）和含1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12预热至37 °C。
- 吸除大鼠星形胶质细胞培养物的旧培养基。加入5 mL DPBS轻轻晃动清洗培养物。
- 吸除DPBS，加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。轻轻晃动使溶液均匀分布。在含5% CO2的湿润37 °C培养箱中孵育5–10分钟 。
- 在显微镜下检查细胞是否已脱落。通过轻敲培养瓶数次使残留细胞脱落。
- 向培养瓶中加入5 mL DMEM/F12。用10 mL移液器在瓶内轻轻吹打细胞。将细胞悬液收集至15 mL离心管中。以200 × g离心8分钟。
- 吸除上清液，用1 mL DMEM/F12重悬细胞。使用血细胞计数板测定细胞数量（细胞/mL）。
- 向每个6孔MEA孔中加入7.5 × 104 个星形胶质细胞。将MEA置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜（O/N）培养。
- 更换培养基（第4天）
- 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。此外，加入阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside）至终浓度2 µM。
注意： 阿糖胞苷用于抑制星形胶质细胞增殖，并清除未向神经元分化的残余hiPSCs。
- 过滤培养基并预热至37 °C。吸除6孔MEA各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA维持在含5% CO2的湿润37 °C培养箱中培养。
- 更换培养基（第6–28天）
注意： 从第6天开始，每隔两天更换一半培养基。从第10天起，培养基中需补充胎牛血清（FBS）以维持星形胶质细胞的存活。
- 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。从第10天起，还需在培养基中补充2.5%（v/v）FBS。过滤所得培养基并预热至37 °C。
- 使用1000 µL移液器吸除6孔MEA各孔中一半的旧培养基，替换为新配制的培养基。将6孔MEA维持在含5% CO2的湿润37 °C培养箱中培养。
2. 建立由 hiPSC 分化神经元的神经生理学特征
注意： 在诱导分化后两到三周，可将hiPSC来源的神经元用于不同的下游分析。本节提供了一些可执行的下游分析示例，以建立hiPSC来源神经元的神经生理学特征谱型。
- 使用多电极阵列（MEAs）表征神经元网络活动
- 记录在多电极阵列（MEAs）上培养的人诱导多能干细胞（hiPSC）来源神经元的20分钟电生理活动。记录期间，保持温度为37 °C，并通过向MEA表面持续通入缓慢流动的加湿气体（5% CO2、20% O2、75% N2）以防止培养基蒸发和pH值变化。
- 经1200倍放大（MEA 1060，MCS）后，使用MCS数据采集卡以10 kHz采样频率采集信号。使用自定义软件包分析数据（包括动作电位和簇状放电检测）。