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所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 溶液的配制
- 标准人工脑脊液（ACSF；表1）
- 使用高纯度盐类和已用双蒸水冲洗过的洁净玻璃烧杯配制新鲜溶液。所有细胞外和细胞内溶液均应使用高质量的双蒸水配制。
- 根据表1，取一个2 L烧杯将NaHCO3溶解于500 mL水中，另取一个烧杯溶解其他盐类，以防止二价离子沉淀。每次取用不同盐类前，需系统地用双蒸水清洗药匙并干燥。使用磁力搅拌器促进溶解。将两个烧杯中的溶液合并至适当的容量瓶中，并定容至所需体积。
- 确保最终的细胞外溶液完全透明，无任何沉淀痕迹。
- 在灌注脑片前20–30分钟，使用玻璃微孔滤器（Ø 13 mm）向溶液中通入由95% O2和5% CO2组成的混合气体（碳合气体）。使用渗透压计仔细测定ACSF的渗透压（进行2–3次连续测量），理想范围为314–325 mOsmol/L。配制完成后，将剩余溶液储存于4 °C，3天内使用完毕。
- 切片溶液（蔗糖-ACSF；表2）
- 配制3 L新鲜溶液。每只动物的脑片制备使用1 L。剩余溶液储存于4 °C，3天内使用完毕。
注意： 采用高浓度Mg2+和低浓度Ca2+以降低突触传递，部分NaCl被蔗糖替代以保护组织完整性。
- 细胞内溶液
- 预先配制100 mL用于双全细胞记录的溶液（表3）。
- 加入甲基硫酸盐以获得良好的细胞形态恢复效果。添加生物胞素（0.1–0.4%）以便后续观察神经元形态。可选择性加入荧光染料（例如，Alexa 594或Sulforhodamine 101 41），用于记录过程中追踪树突延伸情况。
- 预先配制100 mL用于细胞贴附记录的电极内液（表4）。该情况下，内液为高K+溶液，旨在分离宏观的超极化激活阳离子电流（Ih），并含有其他电压门控离子通道的阻断剂。
- 将细胞内溶液分装为每管2 mL，于-20 °C保存。每次新的记录实验均使用新分装的溶液。每次解冻后，务必使用渗透压计仔细检测每管溶液的渗透压。若渗透压与初始值不符，则更换新分装管。
- 将分装管中的溶液转移至一个3 mL注射器中，注射器顶端安装0.22 µm无菌滤器。记录期间将注射器置于冰上，以减缓其中化合物（ATP、GTP或磷酸肌酸）的降解。
2. 制备和填充膜片电极
- 拉制
- 使用水平电极拉制仪和厚壁硼硅酸盐玻璃管。进行全细胞和细胞贴附记录时，使用外径2 mm、内径1 mm的玻璃管。确保玻璃管绝对清洁。
- 若不满足此条件，先将玻璃毛细管浸入有机溶剂（例如乙醇），然后浸入双蒸水中。用本生灯短暂加热毛细管末端。或者，可直接从制造商处订购已清洗并加热处理的玻璃管（参见材料列表）。
- 进行双体树突记录时，确保细胞体电极在填充细胞内液后电阻为6–10 MΩ，树突电极电阻为8–19 MΩ（表3）。为在神经元胞体-树突区域获得可比结果，细胞贴附记录所用电极的电阻应标准化为10 MΩ。
- 每次记录前（每天）或封接前立即制备新鲜电极，并在拉制后5–8小时内使用。将电极存放于带盖的玻璃容器中，以防灰尘污染及尖端堵塞。
- 抛光
- 使用显微 forge 对每个电极尖端进行检查并进行热抛光，以获得与细胞膜更佳的封接效果。使用显微 forge 前，先在铂金加热丝上熔化一小块玻璃。为保持一致性，应每天更换铂金丝上的玻璃涂层（Peter Jonas，个人通讯）。
注意：用于细胞贴附记录的电极可在热抛光步骤前进行涂层处理，以降低背景噪声。可使用熔融牙科蜡或硅酮弹性体等绝缘材料对电极进行涂层。
3. 脑切片的制备
- 使用16至19日龄的健康Wistar大鼠。不要使用不健康、低体温或脱水的动物。在开始切片制备前，将动物置于安全且安静的环境中。准备动物时，避免房间内有其他动物。操作动物时应轻柔。
- 将蔗糖-ACSF溶液倒入两个400 mL的聚丙烯（PP）烧杯中，放入-80 °C冰箱冷冻45分钟。混合溶液使其成为均匀的冰冻/冰凉液体，并将烧杯置于冰上。使用微孔滤器烛管（Ø 13 mm）向每个PP烧杯中的蔗糖-ACSF溶液通入碳氧混合气（carbogen）。
- 准备切片机和保存室
- 使用高质量的组织切片机，其垂直振动应极低，以尽可能减少对切片表层的损伤。在切片机上安装新鲜且完整的剃须刀片。
- 每次切割均使用新的剃须刀片。避免刀片弯曲。不要去除刀片表面的脂肪膜（Josef Bischofberger，个人交流）。
- 如有条件，使用制造商提供的振动探针检测垂直振动。或者使用自制的振动探针。将刀片的垂直振动降至尽可能接近0 µm。
- 准备一个150 mL的切片保存室。向保存室中加入标准ACSF溶液，并将其置于水浴中。使用微孔滤器烛管（Ø 6 mm）向保存室溶液通入碳氧混合气。确保碳氧混合气产生的气泡尽可能微小。
注意：每2至3个月新建一个保存室，以保持切片质量稳定。
- 切片
- 在安静、不受干扰或压力影响的实验室内，使用手术剪刀（长150 mm）在颈髓水平处将动物断头。
- 用解剖刀从鼻部向尾部方向切开头顶皮肤并横向移除。用精细剪刀从头部尾侧向鼻侧方向剪开颅骨顶部，并横向移除两侧颅骨。用细小的刮勺取出脑组织，小心地将其放入盛有冰冻（0 - 4 °C）且经碳氧混合气平衡的蔗糖-ACSF溶液的PP烧杯中。
注意：此操作步骤需尽可能迅速但细致地完成（<<1分钟，约40秒）。
- 将脑组织在PP烧杯的溶液中静置约2至5分钟。调节碳氧混合气压力以防止脑组织移动。若气泡过大，应更换新的微孔滤器烛管。
- 将脑组织置于一个内底涂有约0.5 cm厚Sylgard层的9 cm培养皿中。该培养皿需提前准备。
- 用冰冻的蔗糖-ACSF溶液包围脑组织。确保部分ACSF-蔗糖溶液液相浸没脑组织。对于冠状切片，使用解剖刀或剃须刀片在冠状面上切除脑的前部。通过冠状切口去除小脑。
- 在样品托盘（面积约1 cm2）上涂抹氰基丙烯酸酯胶水。将脑块粘贴固定，使其前部朝向切片台。使用玻璃巴斯德移液管的大口径端，小心地在已固定的脑组织上滴加蔗糖-ACSF溶液，随后缓慢将切片机的切割室浸入溶液中。调整样品托盘，使切割面（即最先接触刀片的组织面）为脑的腹侧表面。
- 可选操作：使用弯曲的玻璃微孔滤器烛管（Ø 6 mm）向切割室通入碳氧混合气。
- 将剃须刀片调整至相对于水平面约15°的角度。在到达黑质之前，从尾侧向鼻侧方向切割约500 µm厚的冠状脑切片。随后减薄至300 - 350 µm，以获取包含目标区域的切片。
- 使用连接注射器、平行于剃须刀片边缘的极细灌流针将切片从组织块上分离。将针头弯曲，使其与注射器之间形成90°夹角。在将切片从组织块上分离时，确保不对剃须刀片施加任何压力。
- 保存切片
- 使用玻璃巴斯德移液管（连接橡皮球）的大口径端将切片转移至保存室中。待所有切片转移完成后（Christoph Schmidt-Hieber，个人交流），将水浴温度升至34 °C，维持0.5 - 1小时。
- 此阶段结束后关闭水浴，将切片置于室温下保存。调节碳氧混合气压力，避免切片在保存室中移动。在开始记录前，再继续孵育10至20分钟。
- 切片操作结束后，仔细而彻底地用双蒸水清洗设备和微孔滤器烛管。
4. 黑质神经元中的双体细胞与体树突记录及生物胞素填充
- 按照《Axon 指南》中所述，组装用于脑片的膜片钳装置。
- 准备记录室
- 在记录室中加入 1 - 2 mL 双蒸水，检查是否漏液。将记录室放置在可移动的 x-y 平移台上。
- 通过氧不可渗透的灌流管路系统（聚四氟乙烯）将标准人工脑脊液（ACSF）导入记录室，调节灌流速度至 4 - 5 mL min-1 并保持稳定。连接 ACSF 储液瓶与记录室的管路应尽可能短（1 m）。
- 从备用室中选取一片脑片，使用最大口径的玻璃巴斯德移液管将其转移至记录室。用铂金丝环将脑片固定在记录室底部。使用一个平面铂金环（Ø 1.5 cm），并在其上平行粘贴尼龙丝线（间距 >2 mm）。
- 调节并优化光学系统
- 使用红外（IR）视频显微镜观察脑片。调节科勒照明 51，并优化微分干涉差（DIC）光学系统或斜射照明（Dodt 梯度反差 - DGC）。
- 检查脑片质量。仅保留表面平滑、对比度适中、仅有少量分散小坑的脑片。
- 用细胞内液填充 2 支全新未使用的膜片移液管（表 3）。使用含有移液管溶液的 0.5 mL 离心管，通过毛细作用将溶液吸入移液管尖端。对于无 filament 的移液管，可通过连接注射器的管路对移液管末端施加负压，以加快尖端填充速度。
- 将移液管置于脑片表面之上
- 检查银丝表面是否存在氯化银涂层。
- 依次将移液管插入移液管夹持器中，并通过连接移液管夹持器、三通阀和压力计的管路系统施加正压（约 70 mbar）。将移液管缓慢下降至记录室的浴液中。
- 观察压力计读数是否在约 1 - 2 分钟内保持恒定。若压力下降，检查管路或移液管夹持器内的密封 O 形圈。
- 将移液管尖端置于视频监视器中央，确保无遮挡。确认在施加或释放压力时，移液管尖端不发生移动。
- 在监视器中心精确对准移液管尖端位置画一小十字，观察 5 分钟内尖端是否有漂移或振动。
- 施加一个电压阶跃（5 mV），在示波器上监测移液管电阻。将膜片钳放大器的保持电位设为 0 mV，并调节移液管偏移电位，使放大器表头显示的直流移液管电流为零。
- 将移液管缓慢下移至脑片附近，并保持在脑片表面之上。
- 选择并封接具有长树突的神经元
- 在黑质区域，使用红外-Dodt 梯度反差（IR-DGC）技术选择一个健康、具有长树突且可在大致同一平面上连续追踪较长距离的神经元（图 1A 和 图 1B）。选择胞体平滑且均一的细胞。避免选择位于脑片表面、对比度过强的两类细胞（图 1C 和 图 1D），因为这类细胞难以形成穿孔，且难以长期维持稳定的记录条件（稳定的串联电阻）。应选择胞体位于脑片表面下 10 - 30 µm 的神经元。
- 将胞体电极移至靠近胞体的位置（距离约 40 - 50 µm），同时将树突电极移至距离树突相同距离的位置。使用 2X 放大倍率（四倍转盘）选择并封接一段树突。在监视器上，无额外放大（1X）时应达到 2,100X 的绝对放大倍率，使用 2X 放大时应达到 5,500X。
- 将胞体移液管压力略微释放 10 mbar。如有必要，调节树突和胞体移液管的压力，以避免脑片内细胞结构（胞体和树突）发生位移。
- 将树突移液管靠近细胞膜，直至观察到轻微凹陷。释放移液管尖端压力，在监测移液管电阻的同时封接树突。理想情况下，仅需极轻微的负压即可形成良好的封接。
- 使用高增益、低滤波 51 的电压脉冲和示波器，尽可能减小电流阶跃上方的移液管电容瞬变幅度。用树突移液管进入全细胞记录模式。