大鼠脊髓运动神经元的经脊髓直流电刺激

摘要

来源：Bączyk, M., 等 在经脊髓直流电刺激期间对类型鉴定的大鼠脊髓运动神经元进行体内细胞内记录。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了在经脊髓直流电刺激下对大鼠运动神经元进行的体内细胞内记录。该方案描述了如何在脊髓阳极或阴极极化前、期间和之后，测量运动神经元的膜特性并记录其节律性放电活动。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

注意：参与该操作的每位人员都必须接受过基本外科手术操作的适当培训，并持有进行动物实验的有效许可证。

1. 麻醉与术前用药

1. 用戊巴比妥钠（初始剂量60 mg·kg⁻¹）经腹腔注射麻醉大鼠^-1 适用于6月龄、体重400‒550 g的雄性Wistar大鼠。
   注意： 本方案不限于所述大鼠品系、性别或年龄。此外，若出于不同研究目标需要或伦理委员会要求，可使用其他麻醉剂，如氯胺酮-赛拉嗪混合剂、α-氯醛糖或芬太尼+咪达唑仑+美托咪定。
2. 大约5分钟后，用钝头镊子夹捏大鼠后肢脚趾，检查麻醉深度。只有在未观察到反射反应时，方可进行后续操作步骤。
3. 皮下注射0.05 mL阿托品，以减少插管后黏液分泌。
4. 皮下注射5 mL磷酸盐缓冲液，其中含4%葡萄糖溶液、NaHCO3（1%）和明胶（14%）。该缓冲液将在整个实验过程中被皮肤血管吸收，有助于维持体液平衡。
5. 手术过程中，应定期检查动物的反射反应，必要时补充麻醉（10 mg·kg^-1· h^-1 戊巴比妥钠

2. 手术

1. 为动物进行手术处理前的准备：剃除左后肢背侧从踝关节至髋部、背部从尾部至高位胸段（Th）、左侧胸部以及胸骨上方颈部腹侧区域的毛发
2. 静脉通路的建立
   1. 将大鼠仰卧位放置于闭环加热垫上，并用肢体固定装置固定。
   2. 使用21号刀片，从胸骨沿中线向头侧方向做一纵向皮肤切口至下颌。
   3. 用镊子夹住皮肤并将其与下方组织分离。
   4. 采用钝性分离技术暴露右侧颈静脉，小心地将静脉从周围组织中游离出来。
   5. 找到无分支的静脉段，在其下方穿入两根4-0缝线。
   6. 在先前确定的无分支静脉段近心端打一个松结，在该静脉段远心端也打一个松结。用夹子夹闭近心端静脉，然后结扎远心端静脉。
   7. 使用虹膜剪在夹子与远端结扎线之间剪开静脉。提起静脉的一瓣，将预先充满液体的导管插入至被夹子阻挡的位置。
   8. 用镊子同时夹住静脉和导管，移除夹子后将导管向静脉内推进数毫米。将导管两端固定于静脉上，并在皮肤上增加一个额外的固定点。

3. 气管导管的插入

1. 使用钝头镊子分离覆盖在胸骨舌骨肌上的两个下颌下腺。沿中线分离胸骨舌骨肌，以暴露气管。
2. 将三根4-0缝线穿过气管下方，然后在气管插管插入点下方打两个结，在上方打一个结。
3. 定位喉部的环状软骨，并在第三气管软骨环下方做一切口。
4. 将气管插管沿气管插入，并用预先准备好的缝线固定插管，然后另加一根缝线固定于皮肤。
5. 在分离的肌肉上方放置一小块脱脂棉，然后缝合皮肤覆盖手术区域。

4. 后肢神经的解剖

1. 使用21号刀片，在左后肢后侧从跟腱至髋关节处做一纵向切口。
2. 用镊子夹住皮肤，采用钝性分离技术，将切口两侧的皮肤与下方肌肉组织分离。
3. 定位膝关节后方的腘窝，该区域被股二头肌覆盖，用剪刀在该肌的前、后部分之间剪开。
4. 向上分离，将股二头肌的两个头完全切断至髋部，以暴露坐骨神经。必要时进行电凝止血。
5. 辨认坐骨神经的腓肠神经、胫神经和腓总神经分支。
6. 使用剪刀将腓肠肌外侧头与内侧头分开，以暴露胫神经及其分支。
7. 使用55号镊子夹住腓肠神经的远端，远端切断后，尽可能向远端充分游离该神经。
8. 对腓总神经重复上述操作。
9. 使用钝头玻璃棒小心将胫神经从周围组织中分离，注意避免损伤血管，并在远端切断该神经。
10. 辨认内侧腓肠肌神经（MG）以及外侧腓肠肌和比目鱼肌神经（LGS）。
11. 使用55号镊子，仔细游离MG神经和LGS神经，将其与周围组织分离，但保持其与相应肌肉的连接。
12. 在暴露的神经下方放置一块浸有生理盐水的棉球。
13. 将皮肤缝合覆盖手术区域。

5. 椎板切除术

1. 使用21号刀片，从骶骨向上至胸椎做一纵向切口。
2. 将皮肤与下方肌肉分离。
3. 在胸椎和腰椎棘突两侧切断最长肌。
4. 使用钝头解剖刀，将肌肉从脊柱上推开，暴露每节椎骨的横突。
5. 使用钝头剪刀，沿暴露的脊柱剪断连接于横突的肌肉肌腱。必要时使用止血剂止血。
6. 确定Th13椎骨为具有肋骨附着的最下位胸椎节段，并使用精细咬骨钳去除Th13至L2椎骨的棘突和椎板，以暴露腰段脊髓。注意勿损伤L3棘突，该结构将作为脊柱固定的锚定点。
7. 去除Th12棘突，并尽可能将椎骨背侧表面修平。
8. 采用钝性分离技术，从Th11椎骨处分离肌肉，以创建用于固定装置插入的定位点。
9. 将薄层生理盐水浸湿的棉片覆盖于暴露的脊髓节段上。
10. 将大鼠转移至特制的金属框架上，该框架配有两根平行杆和两个带夹具的可调节臂，用于支撑和稳定脊柱。

6. 记录与刺激的准备工作

1. 脊柱固定与神经布置
2. 将大鼠置于连接闭环加热系统的定制框架中，并放置在加热垫上，以维持动物体温在 37 ± 1°C。
3. 将心电图（ECG）电极插入皮下，并连接至放大器以监测心率。
4. 利用皮肤瓣，在暴露的脊髓上方形成一个深部油池。
5. 使用金属夹，将夹子置于 Th12 横突下方和 L3 棘突处，以固定脊柱。
6. 确保脊柱已牢固固定并保持水平，然后在脊柱两侧施加背腹向压力以牵开肌肉。
7. 用温热（37 °C）的矿物油填充油池，并维持该温度。
8. 将 4-0 缝线穿过跟腱，提起并拉伸手术侧左后肢，使踝关节与髋关节处于同一水平。
9. 利用皮肤瓣，在暴露的胫神经、MG 神经和 LGS 神经上方形成一个深部油池。
10. 用温热（37 °C）的矿物油填充油池。
11. 将 MG 神经和 LGS 神经置于双极银丝刺激电极上，并连接至方波刺激器。每个神经使用独立的刺激通道。

7. 表面电极放置

1. 将银球电极置于暴露的脊髓左侧尾侧，参考电极插入背部肌肉中，并将两个电极连接至差分直流放大器。表面球状电极用于记录来自神经的传入冲动群。
2. 使用恒流刺激器，以持续时间为 0.1 ms 的方波脉冲刺激 MG 和 LGS 神经，刺激频率为 3 Hz，观察传入冲动群。
3. 确定神经激活的阈值（T），以约 3·T 的强度刺激每根神经，并记录每根神经传入冲动群的幅度。
4. 将表面电极向头端移动并重复该步骤，以确定每根神经冲动群幅度最高的脊髓节段。确定最大冲动群位置后，将表面电极移至远离脊髓的安全位置。
5. 肌肉麻痹并建立气胸以减少呼吸运动
6. 通过静脉注射神经肌肉阻断剂使大鼠肌肉麻痹，并将气管插管连接至外置呼吸机，呼吸机需配备适用于啮齿类动物的二氧化碳监测仪（潘库溴铵，初始剂量为 0.4 mg·kg^-1，之后每 30 分钟追加 0.2 mg·kg^-1）
7. 监测呼气末 CO₂ 浓度，并通过调节通气参数（频率、气道压力和潮气量）将其维持在约 3‒4%。
8. 在记录侧第 5 与第 6 肋之间皮肤做纵向切口。
9. 使用钝头剪刀剪开覆盖的肌肉，暴露肋间间隙。
10. 使用小型锐利剪刀在肋间肌和胸膜上做小切口，然后将钝头镊子尖端插入切口，注意避免压迫肺组织。
11. 保持镊子张开状态或插入小管，以确保在整个实验过程中气胸保持开放。
12. 神经肌肉阻断后，通过监测心电图频率评估麻醉深度，若心率超过 400 次/分钟，则追加麻醉剂。肌肉麻痹并建立气胸以减少呼吸运动，从而提高记录稳定性。

8. 打开硬脑膜和软脑膜

1. 使用 #55 镊子轻轻提起硬脊膜，并从 L5 节段向尾侧开始剪开，向前至 L4 节段。
2. 使用一对超细 5SF 镊子，在血管之间的背柱软脑膜上制造一个小孔，位置应精确对应来自 MG 或 LGS 神经的最大传入放电波水平。
3. 必要时可用少量浸有生理盐水并吸干的明胶海绵碎片止血。

9. 经脊髓直流电刺激（tsDCS）电极放置

1. 在大鼠腹部腹侧相当于腰段（L）4-L5脊髓节段位置处，做一微小皮肤切口。
2. 用金属夹夹住暴露的皮瓣，作为参考电极。
3. 将一块浸有生理盐水的海绵置于胸段（Th）12椎体的背侧。确保海绵大小与主动tsDCS电极相同（直径为5 mm的圆形不锈钢板）。
4. 使用精细操纵器将主动tsDCS电极压在海绵上，使其紧贴骨面，并确保电极整个表面均匀受压。
5. 将参考电极和主动tsDCS电极连接至可提供持续直流电流的恒流刺激仪装置。

10. 微量移液管的制备

1. 使用微电极拉制仪制备微电极。
   注意：可使用带纤维丝或不带纤维丝的电极。但需注意，电极的杆部必须足够长以到达脊髓腹角，同时又足够细，以免在插入过程中压迫脊髓。
2. 调整拉制仪参数，使进入脊髓的电极杆部长度约为 3 mm，电极尖端直径不超过 1‒2 µm，微电极阻抗介于 10 至 20 MΩ 之间。
3. 用 2M 柠檬酸钾电解液填充微电极。
4. 将制备好的微电极安装到显微操作器上，确保可实现 1‒2 µm 的步进移动，并进行立体定位校准。
5. 将微电极连接至细胞内放大器，参考电极置于背部肌肉中。
6. 给予神经肌肉阻滞剂后，通过监测心电图（ECG）频率来评估麻醉深度，并追加麻醉剂，使大鼠心率不超过 400 bpm。

11. 运动神经元追踪与穿刺

1. 将传入放电记录电极重新放置在脊髓背侧表面，位于记录位点尾侧，L6节段水平。
2. 以0.1 ms的电脉冲、3 Hz的频率和3T的强度刺激内侧腓肠肌（MG）以及外侧腓肠肌和比目鱼肌（LGS）神经，以激活所选神经内所有α-运动神经元的轴突。
3. 以15‒20°的内-外侧角度（电极尖端朝向外侧）将微移液管插入软脑膜的选定区域。
4. 在电极进入表面以下后，校准微电极并补偿其电容和电压偏移；当所有参数稳定后，继续穿透脊髓组织。在刺激相应神经时，随着接近特定的运动核团，可在微电极电压记录轨迹中观察到运动神经元池的逆向场电位。
5. 以1‒2 µm的步进继续微电极的穿透，并定期使用细胞内放大器的“buzz”功能清除电极尖端的残留物。
6. 观察运动神经元的穿刺过程，其特征为记录电压轨迹突然出现超极化，并出现逆向锋电位。

12. 记录运动神经元膜电位及放电特性

1. 在细胞内放大器的桥接模式下，通过刺激相应的神经分支，根据逆向动作电位“全或无”的特征识别运动神经元。记录随后的20次追踪曲线，用于后续平均处理。
2. 采用严格的纳入标准以确保数据质量：静息膜电位绝对值至少为 -50 mV；动作电位幅度大于 50 mV，且具有正向超射；在记录前膜电位稳定至少 5 分钟。
3. 在细胞内放大器的断续电流钳模式（电流切换速率模式 4–8 kHz）下，使用 0.5 ms 的细胞内去极化电流脉冲诱发运动神经元的顺向动作电位。重复至少 20 次，用于离线平均。
4. 使用 40 次短脉冲（100 ms）的超极化电流（1 nA）刺激运动神经元，以计算细胞的输入电阻。
5. 使用逐渐增加幅度的 50 ms 方波脉冲刺激运动神经元，确定阈电流值（rheobase），即诱发单个动作电位所需的最小去极化电流幅度。
6. 注入持续 500 ms、幅度逐步增加（步长为 0.1–2 nA）的去极化方波电流脉冲，以诱发运动神经元的节律性放电。

13. 经脊髓直流电刺激（tsDCS）

1. 在保持运动神经元稳定穿刺的同时，通过脊髓直流电刺激开始极化程序。根据实验设计调整电流强度和刺激时间（例如，0.1 mA，持续15分钟）。
2. 在开启直流电后立即观察运动神经元的膜电位。阳极极化（主动电极为阳极）应导致膜电位去极化，而阴极极化（主动电极为阴极）则引起相反效应。观察膜电位在直流电刺激下的静息电位变化是否稳定，以确保电场强度未受影响。
3. 在持续电流刺激过程中，每隔5分钟重复步骤5.3‒5.6。
4. 关闭直流电后，继续每隔5分钟重复步骤5.3‒5.6，直至记录不稳定或不符合纳入标准为止。
5. 终止实验，并通过静脉注射戊巴比妥钠致死剂量（180 mg·kg^-1）处死动物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
药物与溶液	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
葡萄糖	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	神经肌肉阻滞剂
戊巴比妥钠	Biowet Puawy Sp. z o.o	-	主要麻醉剂
柠檬酸钾	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES 溶液
手术器械	-	-	-
21 号刀片	FST	10021-00	手术刀片
电凝器	FST	18010-00	-
胸腔引流管	Mila	CT1215	-
Dumont #4 镊子	FST	11241-30	肌肉镊
Dumont #5 镊子	FST	11254-20	硬脑膜镊
Dumont #5F 镊子	FST	11255-20	神经镊
Dumont #5SF 镊子	FST	11252-00	软脑膜镊
镊子	FST	11008-13	钝头镊
镊子	FST	11053-10	皮肤镊
止血钳	FST	13013-14	-
咬骨钳	FST	16021-14	用于椎板切除术
剪刀	FST	15000-08	静脉剪
剪刀	FST	15002-08	硬脑膜剪
剪刀	FST	14184-09	用于气管切开
剪刀	FST	104075-11	肌肉剪
剪刀	FST	14002-13	皮肤剪
气管插管	-	-	定制
静脉导管	Vygon	1261.201	-
血管插管镊	FST	18403-11	-
血管夹	FST	18320-11	用于静脉夹闭
血管扩张探针	FST	10160-13	用于静脉解剖
手术材料	-	-	-
明胶海绵	Pfizer	GTIN 00300090315085	止血剂
4.0 丝线缝合线	FST	18020-40	-
6.0 丝线缝合线	FST	18020-60	-
设备	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	已停产	细胞内放大器/新型号 Axoclamp 900A
CapStar-100 呼气末 CO2 监测仪	CWE	11-10000	气体分析仪
Grass S-88	A-M Systems	已停产	恒流刺激器
带柔性探针的恒温毯系统	Harvard Apparatus	507222F	加热系统
ISO-DAM8A	WPI	74020	细胞外放大器
显微操作器	-	-	定制/替代 IVM/Scientifica
P-1000 微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-1000	微电极拉制仪
SAR-830/AP 小动物呼吸机	CWE	12-02100	呼吸机
支撑架	-	-	定制/替代实验室标准底座 51601/Stoelting
脊柱夹具	-	-	定制/替代大鼠脊柱适配器 51695/Stoelting
TP-1 直流刺激器	WiNUE	-	经颅直流电刺激器
其他材料	-	-	-
1B150-4 玻璃毛细管	WPI	1B150-4	用于微电极制备
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