使用全细胞膜片钳技术对内侧前庭核神经元施加噪声电流

摘要

来源：Stefani, S. P.，等。随机噪声刺激在体外评估内侧前庭核神经元敏感性中的应用。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种实验方案，该方案采用全细胞膜片钳技术，向内侧前庭神经核神经元施加阈下噪声电流，以研究噪声电流对神经元电刺激敏感性的影响。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 动物

注意：小鼠购自澳大利亚啮齿类动物中心（ARC；澳大利亚珀斯），并饲养于悉尼大学医学基金会大楼动物实验中心。

1. 将小鼠饲养在标准的12小时光照/12小时黑暗循环环境中，并提供环境丰富化措施。
2. 所有实验均使用雄性和雌性C57BL/6小鼠（3–5周龄）。

2. 溶液的配制

1. 配制1 L人工脑脊液（ACSF），其中包含29 mM NaHCO₃、11 mM葡萄糖、120 mM NaCl、3.3 mM KCl、1.4 mM NaH₂PO₄、2.2 mM MgCl₂、2.77 mM CaCl₂。
2. 配制200 mL蔗糖-人工脑脊液（sACSF），其中包含29 mM NaHCO₃、11 mM葡萄糖、241.5 mM蔗糖、3.3 mM KCl、1.4 mM NaH₂PO₄、2.2 mM MgCl₂、2.77 mM CaCl₂。在向ACSF和sACSF中加入CaCl₂之前，需用碳氧混合气体（95% O₂ 和 5% CO₂）通气，使溶液pH值达到7.4，以避免钙盐沉淀（溶液浑浊）。
3. 配制基于K⁺的细胞内液，成分为70 mM葡萄糖酸钾、70 mM KCl、2 mM NaCl、10 mM HEPES、4 mM EGTA、4 mM Mg₂-ATP、0.3 mM Na₃-GTP，最终pH值为7.3（用KOH调节）。
   注意：建议将细胞内液经0.22 μm滤器过滤后，分装为0.5 mL等份，于-20 °C保存。

3. 脑干的制备

1. 在提取脑干之前，先用碳合气体（carbogen）平衡sACSF，并在-80 °C下冷却25分钟，形成冰浆。
2. 使用氧气（3 mL/min）饱和的异氟烷（3–5 %）麻醉小鼠。当后肢足底反射消失后，用锋利的不锈钢剪刀剪除小鼠头部。
3. 使用刀片（#22圆头）在皮肤上做矢状切口，暴露颅骨。
4. 使用标准剪刀的尖端，在人字缝处做小切口，并沿纵裂进行剪切。
5. 使用浅弯Pearson咬骨钳小心掀开成对的顶骨和枕骨。
   注意： 此过程中，脑组织持续在原位浸泡于先前制备的冰冷sACSF冰浆中。
6. 使用刀片（#11直头）沿顶枕沟和延髓尾端切割，将脑干从端脑及其骨性包膜中分离出来。
7. 将分离出的脑干腹侧端固定在一个预先切成梯形的聚苯乙烯块上。使用滤纸条吸除组织周围多余液体，确保组织与切片台之间良好粘附。
   注意： 聚苯乙烯块被切成梯形，以确保中脑前端能够适配并逐渐过渡至脊髓。
8. 使用氰基丙烯酸酯胶水将附有脑干（头端朝下）的聚苯乙烯块固定在切片台上。
9. 以0.16 mm/s的进刀速度和3.00 mm的振动幅度，制备200 μm厚的前庭内侧核（MVN）横切片。
   注意： MVN的位置根据Paxinos和Franklin小鼠脑图谱确定。MVN（在图谱中列为MVe）位于第四脑室腹外侧，紧邻小脑附着处之前（介于下丘与延髓末端之间），在此区域体积最大。
10. 使用塑料修整过的移液管将切片转移至盛有碳合气体饱和ACSF的滤纸圆片上，在25 °C下孵育至少30分钟，然后开始记录。

4. 仪器

1. 使用标准的电生理装置进行全细胞膜片钳技术操作。
2. 使用微电极拉制仪（见材料表）采用两步加热法（第一步加热值：70；第二步加热值：45）制备微电极。
3. 微电极置于浴液中时，其在内液中的最终电阻应在 3 至 5 MΩ 范围内。
   注意：所用参数可能因室内温度不同而有所差异，且可能频繁变化。

5. 全细胞膜片钳电生理学

1. 为了从内侧前庭核（MVN）的单个神经元获得全细胞膜片钳记录，需在记录电极内使用基于钾离子（K⁺）的细胞内液。
2. 将一片脑组织切片从孵育槽转移至记录槽中，并用尼龙线固定在U形重物上。以3 mL/min的流速持续向记录槽灌流含碳合气的任氏液（ACSF），温度维持在25 °C。
3. 在将微电极填充细胞内液后，先使用低倍率（10×）物镜定位内侧前庭核（MVN）。再切换至高倍率（40×）物镜，以识别MVN内的单个神经元。
   注意：细胞质量对于获得高质量的记录以及在建立全细胞构型过程中维持细胞的稳定性至关重要。理想的细胞应呈球形，细胞膜具有反光性，细胞核不可见。不适宜的细胞则表现为细胞核明显增大（呈卵形），并伴有肿胀或皱缩的形态。
4. 在电极接触组织前，施加少量正压，以防止碎屑堵塞电极尖端。
5. 使用显微操作器将电极移向目标神经元，此时神经元膜上应出现微小凹陷。
   释放正压，并施加少量负压。
6. 当形成1 GΩ的高阻封接后，通过吸管接口对电极施加轻柔、短暂而迅速的负压，以破裂细胞膜，形成全细胞构型。
7. 采用标准技术进行全细胞电流钳记录。

6. 对单个内侧前庭神经核神经元施加正弦波和随机噪声刺激

1. 施加振幅范围为 3 至 24 pA 的随机噪声和正弦噪声，以确定神经元的阈值和放电频率。
2. 通过将较低和较高刺激强度分组来确定感觉阈值，并进行方差分析（ANOVA）以观察是否存在差异（如图 1所示）。
3. 计算在去极化电流脉冲注入（或将要注入）的 10 秒时间段内，每个单独电流水平下的平均放电频率（即共 7 个阶段；图 2）。
4. 利用平均放电频率值绘制放电频率-电流关系图，并进行线性回归分析以确定最佳拟合直线的斜率。该最佳拟合直线的斜率反映神经元增益。

结果

图 1：12 pA 阈值的客观确定。 将小于 12 pA（3 和 6 pA）以及大于 12 pA（18 和 24 pA）的放电率数据合并并取平均值。随后使用单因素方差分析（ANOVA）对假手术组与>12 pA 组之间，以及<12 pA 组与>12 pA 组之间的差异进行统计学显著性分析。*p < 0.05。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CaCl2	Scharlau	CA01951000	用于ACSF和sACSF
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G8270	用于ACSF和sACSF
EGTA	Sigma	E0396-25G	用于含钾细胞内溶液
HEPES	Sigma	H3375-25G	用于含钾细胞内溶液
KCl	Chem-supply	PA054-500G	用于ACSF、sACSF和细胞内溶液
K-葡萄糖酸盐	Sigma	P1847-100G	用于含钾细胞内溶液
Mg-ATP	Sigma	A9187-500MG	用于含钾细胞内溶液
MgCl₂	Chem-supply	MA00360500	用于ACSF和sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	用于含钾细胞内溶液
NaCl	Chem-supply	SO02270500	用于ACSF和细胞内溶液
NaH2PO4.2H2O	Ajax	AJA471-500G	用于ACSF和sACSF
NaHCO₃3	Sigma	S5761-1KG	用于ACSF和sACSF
蔗糖	Chem-supply	SA030-500G	用于sACSF
异氟烷	Henry Schein	1169567762	用于小鼠麻醉
仪器设备
硼硅酸盐玻璃毛细管	Warner Instruments	GC150T-7.5	1.5 mm 外径，1.16 mm 内径，7.5 cm 长度
数据采集软件	Axograph		用于电生理学及分析
弗里德曼-皮尔逊咬骨钳	世界精密仪器	14089	用于解剖
微移液管拉制仪	Narishige	PP-830	用于微量移液器
多钳放大器	Axon Instruments	700B	用于电生理学实验
pH计	Sper 科学	860033	用于内液
标准型剪刀	FST	14028-10	用于解剖
Sutter 微操作器	Sutter	MP-225/M	用于电生理学实验
直立显微镜	Olympus	BX51WI	用于电生理学
振动切片机	Leica	VT1200	用于脑组织切片