通过活细胞荧光成像检测培养神经元中的过氧化氢水平

摘要

来源：Terzi, A. 等，神经发育过程中的活性氧活细胞成像 J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了一种利用 roGFP2-Orp1 生物传感器和活细胞成像技术实时检测视网膜神经节细胞中过氧化氢水平的技术。该方法概述了细胞准备、荧光成像以及过氧化氢水平定量所涉及的各个步骤。

方案

1. 体外 培养的视网膜神经节细胞（RGC）神经元活性氧（ROS）成像

1. 成像当天（通常在细胞接种后6-24小时），在显微镜下检查视网膜神经节细胞，以确认RGC轴突的生长情况。
2. 进行活细胞成像时，将盖玻片从培养皿转移至活细胞成像腔室。
3. 设置显微镜进行成像。使用配备微分干涉差（DIC）物镜、OG590长通红色滤光片和EM-CCD相机的倒置显微镜。
4. 成像前，将含有血清和抗生素的斑马鱼细胞培养基 （ZFCM(+)）更换为不含血清和抗生素的斑马鱼细胞培养基 （ZFCM(-)）。
5. 使用10倍物镜定位细胞后，采用高数值孔径油浸物镜在60倍放大下获取图像，并额外使用1.5倍放大。
6. 首先获取DIC图像，然后使用适当的滤光片组对roGFP2-Orp1进行成像。依次使用405/20 nm和480/30 nm激发滤光片激发roGFP2-Orp1，并在发射光通过二向色镜505DCXR后，使用535/30 nm发射滤光片采集图像。
7. 完成第一组图像采集后，更换为含有不同处理溶液的培养基。每30分钟成像时应更换一次培养基，以避免pH值和渗透压的变化。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿	Sarstedt	83-3900
盖玻片	Corning	2850-22
一次性培养皿（100 × 15 mm）	VWR	25384-094
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	26140087
倒置显微镜	Nikon	TE2000
层粘连蛋白	ThermoFisher Scientific	23017-015
含酚红的 Leibovitz L-15 培养基	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
不含酚红的 Leibovitz L-15 培养基	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
青霉素/链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122
酚红	Sigma Aldrich	P0290
多聚-D-赖氨酸（PDL）	Sigma Aldrich	P7280
Steritop 0.22 µm 滤器	Millipore	S2GPT05RE
氯化钙二水合物	Fisher Scientific	C79-500
葡萄糖	Sigma Aldrich	G7528
HEPES	Sigma Aldrich	H4034