建立用于脑片双光子钙成像的全细胞记录构型

摘要

来源：Camiré, O.，等。脑片中神经元树突的双光子钙成像。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种在脑 hippocampal 切片中进行全细胞膜片钳记录与双光子钙成像的实验方案。该方法可用于研究局部 Ca²⁺ 急性脑片中不同类型神经元树突内的钙瞬变（CaTs）。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1. 初步准备（可选：提前1天准备）

1. 准备三种人工脑脊液（ACSF）溶液（正常溶液、蔗糖溶液和恢复溶液，每种各1 L；见表1）。将溶液的渗透压调节至300 ± 10 mOsm，并将ACSF-蔗糖溶液冷却至接近冰点（0–4 °C）。
   注意：使用低钠切割溶液（ACSF-蔗糖）有助于保持急性脑片表层神经元的存活能力。
2. 配制0.75 mL含红色荧光染料（例如，Alexa-594）和绿色合成钙指示剂（例如，Oregon Green BAPTA-1；见表1）的膜片钳溶液。若需对记录细胞进行事后形态学鉴定，则在膜片钳溶液中加入生物胞素（见表1）。
3. 将溶液的渗透压调节至280 ± 5 mOsm，pH值调节至7.35 ± 0.5。溶液始终保存在冰箱中或置于冰上。
   注意：钙指示剂的选择应基于其动态范围以及所研究Ca²⁺事件的性质。
4. 使用微电极拉制仪，从硼硅酸盐玻璃毛细管（见材料表）拉制膜片钳电极，尖端直径约≈ 2 µm（电极电阻为3–5 MΩ）；从硼硅酸盐θ型玻璃毛细管（见材料表）拉制刺激电极，尖端直径为2–5 µm。
   注意：拉制仪的参数设置需根据拉制仪灯丝类型及特定玻璃毛细管的斜坡测试结果，来确定所制备电极的直径和形状。

2. 全细胞膜片钳记录

1. 将海马脑片置于双光子激光扫描显微镜物镜（放大倍数：40x，数值孔径：0.8）下方的记录浴槽中，并以30–32 °C、流速为2.5–3 mL/min的充氧正常人工脑脊液（ACSF-Normal）持续灌流浴槽。
2. 使用红外微分干涉差（IR-DIC）或Dodt-SGC显微技术，根据细胞的大小、形态和位置定位目标细胞。
   注意： 根据目标神经元群体的不同，可使用转基因小鼠模型以方便地识别目标细胞。在此情况下，可用荧光光源替代本步骤。
3. 用含有红色荧光染料（例如，Alexa-594）的正常人工脑脊液（ACSF-Normal）填充刺激电极。
4. 将刺激电极（连接至电刺激装置）置于脑片上方，使其尖端位于目标细胞所在区域。
5. 用膜片钳溶液填充膜片电极并将其连接至前置放大器头段，然后将电极移至脑片上方，使其尖端正对目标细胞。
6. 将注射器接入三通阀，并通过塑料管连接至膜片电极。使用注射器向膜片电极内注入持续的正压（≈ 0.1 mL），并将三通阀保持在“关闭”位置。
7. 启动放大器控制软件模块，点击“VC”按钮切换至电压钳模式。打开电生理信号采集软件（例如，clampex）以记录电生理信号，并点击“膜测试”（Membrane Test）图标，使其持续输出一个方波电压脉冲（5 mV，10 ms），用于监测电极电阻的变化。
8. 降低膜片电极，使其尖端紧贴目标细胞。当电极与细胞膜接触后，通过将三通阀转至“打开”位置来撤除正压。
   注意： 当观察到电极电阻出现小幅上升（≈ 0.2 MΩ），并在细胞表面因正压作用形成微小凹陷时，可确认已接触细胞膜。
9. 使用连接至三通阀的空注射器对膜片电极施加轻微负压，直至软件显示的电极电阻达到1 GΩ。在数据采集软件的“膜测试”窗口中，将细胞钳制在-60 mV。
10. 持续施加负压，直至细胞膜破裂并形成全细胞记录模式。该状态的识别依据是电极电阻的突然下降（从1 GΩ降至50–500 MΩ，具体数值取决于中间神经元类型）以及“膜测试”窗口中出现较大的电容瞬变信号。

3. 双光子钙（Ca²⁺）成像

1. 若关注兴奋性突触后反应，可在ACSF灌流液中加入GABAA受体阻断剂加巴津（gabazine，10 µM）和GABAB受体阻断剂CGP55845（2 µM）。
2. 在放大器控制软件模块中，通过点击“CC”按钮将膜片钳配置设为电流钳模式，并记录细胞在注入去极化电流（0.8–1.0 nA，1 s）时的动作电位发放模式。等待至少30分钟，使细胞充分填充膜片溶液中的指示剂。
   注意： 细胞的放电模式和活性特征可用于鉴定其亚型， 例如，快速放电细胞。在开始记录钙瞬变（CaTs）之前，必须等待指示剂浓度通过扩散达到稳定，这一点非常重要（参见 表 2 用于故障排除。
3. 动作电位诱发的钙瞬变
   1. 使用图像采集软件开始采集图像。利用红色荧光信号定位目标树突。为确保可观察到明显的反应，应首先选择近端树突（≤ 50 µm），因为在GABA能中间神经元中，动作电位逆向传播的效率可能随着距离增加而显著下降。
   2. 使用图像采集软件中的“矩形工具”，放大目标区域，并切换到“xt （线扫描）模式。将扫描线定位在目标树突分支上。通过采集软件中的激光强度控制器，将双光子激光功率设置在基线绿色荧光刚好可见的最低水平，以避免光毒性。
   3. 在电生理数据采集软件的“Protocol”窗口和图像采集软件中，创建一个所需持续时间的记录试验，并包含所需幅度的胞体电流注入。
      1. 使用图像采集软件，点击“开始记录”按钮，持续采集荧光信号1-2秒。重复图像采集3-10次。单次扫描之间至少间隔30秒，以避免光损伤。若在树突的不同位点进行多次线扫描采集，应以随机顺序进行，以消除顺序效应。
4. 突触诱发的钙瞬变
   1. 使用红色荧光信号定位目标树突。
   2. 将刺激电极置于切片表面目标树突的上方。缓慢将刺激电极下移至位，尽量减少移动以避免干扰全细胞记录构型。将电极定位在距离树突10–15 µm的位置。
   3. 为了在无棘突的树突中可视化突触微区的位置，在图像采集软件中切换到“xt' （线扫描）模式，并将扫描线定位在目标树突分支上。
   4. 在电生理数据采集软件和图像采集软件的“Protocol”窗口中，创建一个在试验开始后触发刺激单元的记录试验。
   5. 使用采集软件，点击“开始记录”按钮，沿树突连续扫描1-2秒。重复采集3-5次，每次扫描之间间隔30秒，以防止光损伤。
      注意： 扫描时长可根据诱发事件的动力学进行调整，但应尽量缩短以避免光损伤（参见 表2 用于故障排除。
   6. 在不同条件下重复步骤 3.4.5例如，不同强度/持续时间的刺激，药理学阻断剂的引入 等等。）取决于所要解决的具体问题。
   7. 当细胞出现健康状况恶化的迹象时停止采集：去极化电位低于 -45 mV，基线 Ca 水平升高²⁺ 水平，树突形态的退化（例如，出泡，断裂；参见 表 2 用于故障排除。
   8. 为获取细胞形态的初步信息并记录刺激电极的位置，需采集 Z-红色通道中细胞的图像堆栈。使用采集软件中的“xyz' 模式下，设置上下堆栈限值以包含所有突起结构，对整个细胞进行成像。将“步长”设为 1 µm，并点击“开始记录”按钮以启动堆栈采集。
   9. 当 Z-stack 采集完成后，使用软件中的“最大投影”选项叠加 stack 的所有焦平面，以验证采集质量。随后，缓慢将记录电极从脑片中撤出。
   10. 固定切片以 事后 形态学鉴定时，使用扁平的画笔迅速将切片从浴槽中取出，并将其置于充满ACSF的培养皿中的两张滤纸之间。将ACSF替换为4%多聚甲醛（PFA）溶液，并将培养皿置于4 °C的环境或冰箱中过夜。

表1：溶液配方。 实验步骤中所用溶液的化合物及其浓度。

溶液	成分	浓度 (mM)
ACSF-正常	NaCl	124
	KCl	2.5
	NaH2PO4	1.25
	MgSO4	2
	NaHCO3	26
	葡萄糖	10
	CaCl2	2
ACSF-恢复	NaCl	124
	KCl	2.5
	NaH2PO4	1.25
	MgSO4	3
	NaHCO3	26
	葡萄糖	10
	CaCl2	1
ACSF-蔗糖	KCl	2
	NaH2PO4	1.25
	MgSO4	7
	NaHCO3	26
	葡萄糖	10
	蔗糖	219
	CaCl2	1
K⁺-基灌流液	K⁺-葡萄糖酸盐	130
	HEPES	10
	MgCl2	2
	磷酸肌酸二(三)盐	10
	ATP-Tris	2
	GTP-Tris	0.2
	生物胞素	72
	Alexa-594	0.02
	Oregon Green-BAPTA-1	0.2

表2：故障排除表。 钙离子（Ca²⁺）成像实验中可能出现的常见问题及其解决方案。

问题	解决方案
无法对健康神经元进行膜片钳记录	检查脑片是否不健康的表现：细胞皱缩或肿胀、细胞核明显可见等。若存在上述情况，应弃用该脑片。同时验证膜片钳电极的电阻以及灌注液的渗透压；若数值不在合适范围内，应予以更换。
树突的荧光信号较弱	延长细胞填充时间。如果存在阻碍灌注液扩散进入细胞的阻塞，可尝试在膜片钳电极内施加轻微负压。
电刺激未能引发 Ca2+ 反应	检查电生理记录中是否存在刺激伪迹。若无伪迹，检查是否存在短路或刺激单元故障。若有伪迹，则提高刺激强度或将刺激电极移近树突。需注意，在研究突触反应时，刺激电极与树突之间的距离不应超过 8 µm，以避免直接去极化树突。
诱发的 Ca2+ 信号过高，导致 Ca2+ 指示剂饱和	降低激光功率。若在多个细胞中仍存在该问题，可选用对 Ca2+ 亲和力较低的其他 Ca2+ 指示剂。
实验过程中基线 Ca2+ 信号逐渐升高	增加单次扫描之间的等待时间。若基线仍持续上升，则应停止数据采集；这表明细胞状态可能正在恶化。
扫描过程中 Ca2+ 信号幅度逐渐降低	降低激光功率或扩大扫描视野（如适用）。
扫描后树突出现碎片化（“起泡”）	降低激光功率或扩大扫描视野。若仅目标树突出现起泡，可选择其他树突并降低激光功率或扩大视野。若多个树突均出现起泡，则应停止数据采集。
扫描后荧光信号在扫描线位置发生“漂移”	通过降低人工脑脊液（ACSF）灌注速度来减少脑片移动。在进行膜片钳记录前，确保脑片已被网状固定器牢固固定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物品系：小鼠 CD1	Charles River	22
氯化钙	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich	230391
多聚甲醛粉末，95%	Sigma-Aldrich	158127
氯化钾	Sigma-Aldrich	P3911
葡糖酸钾	Sigma-Aldrich	P1847
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S8875
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma 盐酸盐	Sigma-Aldrich	T3253
磷酸氢二钠二水合物	Sigma-Aldrich	71643
磷酸二氢钠 一水合物	Sigma-Aldrich	S9638
生物胞素	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 肼	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
三磷酸腺苷 (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
鸟苷三磷酸 (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
磷酸肌酸二(三)盐	Sigma-Aldrich	P1937
链霉亲和素偶联 Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
膜片钳硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta 型硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown 微电极拉制仪	Sutter Instrument
TCS SP5 共聚焦多光子显微镜	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II 钛宝石多光子激光器	Coherent
LAS AF 成像采集软件	Leica Microsystems
温度控制器 TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B 放大器	Molecular Devices
Digidata 1440A 数字转换器	Molecular Devices
共聚焦位移器	Siskiyou
显微操作器	Siskiyou
pClamp 数据采集软件	Molecular Devices
A365 恒流刺激隔离器	World Precision Instruments
Vibraplane 光学平台	Kinetic Systems