大鼠脑内药物微量注射结合电生理记录

摘要

来源：Lai, J.，等。在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制性试剂的微量注射。J. Vis. Exp. (2015)

本方案概述了注射电极的组装及其在麻醉大鼠脑内靶向区域进行精确药物递送的应用，随后通过记录电信号来监测神经元活动。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 记录-注射电极的组装

1. 使用拉针仪拉制一根长约 7 cm 的玻璃毛细管（外径 1 mm）。
2. 打断毛细管尖端，并在光学显微镜下检查开口，确认内径在 30 µm 至 40 µm 之间。
3. 将一根长 7 cm 的银丝插入玻璃毛细管中，使约 1 cm 从玻璃移液管的非拉细端露出。
4. 将多余的银丝部分垂直弯折于玻璃毛细管轴线方向。
5. 在 30 G 规格的皮下注射针针杆上涂抹一滴柔性塑料粘合剂。
6. 按照图 1所示示意图，将 30 G 皮下注射针插入玻璃移液管中。
7. 再添加第二层胶水涂层，以确保玻璃移液管与皮下注射针连接处形成良好密封。
8. 将移液管尖端朝上放置，静置干燥约 12 小时，以确保胶水充分固化。最终成品如图 2所示。

注意：此操作在急性实验中进行，无需对移液器尖端进行灭菌。

2. 动物准备

1. 将大鼠放入麻醉箱中。
2. 使用 4% 异氟烷麻醉 5 至 10 分钟以诱导麻醉。
3. 将动物置于带有加热垫和直肠探头的立体定位仪上，以维持体温在 37 °C。通过鼻罩使用 2% 异氟烷维持麻醉状态。使用耳杆和门齿夹固定大鼠头部。
4. 涂抹眼用软膏或滴眼液，包括 1% 阿托品滴眼液，以促进瞳孔扩张。为防止角膜干燥，约每 30 分钟滴加一次润滑性滴眼液。
5. 剃除头部毛发，并用 10% 聚维酮碘溶液清洁头部。
6. 进行局部麻醉时，通过提起头皮并在 2–3 个位置将针头插入皮下，注射 0.5 ml 的 2% 利多卡因。
7. 通过夹捏脚趾并观察是否无反应来确认麻醉深度足够。此外，需监测心率，确保其处于正常范围（300 至 400 次/分钟）。
8. 使用 #10 手术刀片沿中线直线切开头皮，暴露冠状缝和矢状缝。
9. 用手术铲轻轻推开覆盖颅骨的组织，显露 Lambda 和 Bregma 点。
10. 调整颅骨位置，使 Bregma 和 Lambda 处于同一水平面。
11. 为设定参考点，使用装有玻璃管的立体定位装置，将其准确定位于 Bregma 正上方。此位置将作为前后方向和内外侧方向测量坐标的“零点”。
12. 移动立体定位装置至目标坐标的相应位置，记录立体定位坐标，并在目标区域周围画出方框，标记开颅的位置。
13. 沿标记的方框使用装有灭菌钻头的手术钻缓慢钻孔，避免施加压力以去除骨质。注意不要在同一区域持续钻孔过久，以免产生热量并导致皮层损伤。
14. 当开颅区域周围的颅骨已钻至足够薄时，小心使用镊子移除该部分颅骨，以暴露皮层。
15. 频繁使用人工脑脊液冲洗暴露的皮层，防止组织干燥。
    注意：由于注射电极的尖端足够坚固，能够穿透硬脑膜，因此在大鼠实验中无需切除硬脑膜。

3. 注射系统的填充与安装

1. 用矿物油通过抽吸填充5-10 µl微量注射器。
2. 使用固定玻璃移液管将皮下注射针头填充0.5%芝加哥蓝（CSB）和300 µM γ-氨基丁酸（GABA）的混合溶液，或2%利多卡因与0.5% CSB的混合溶液。所有溶液均用生理盐水稀释。
   1. 若物质较充足，可使用普通注射器进行填充，并采用常规预防措施避免气泡形成。
   2. 若物质较为昂贵，可先用矿物油填充注射电极，再通过抽吸引入化学试剂。由于矿物油与水之间的密度差异较大，因此该物质适用于注射水溶液。
      注意：可加入染料以确认两种液体之间的分界。
3. 为填充注射移液管，先用1 ml注射器抽吸溶液，然后缓慢将其注入移液管中。
4. 仔细检查图1所示区域是否存在泄漏，通过擦拭清洁这些区域，并缓慢推动注射器观察是否有液体渗漏。
5. 取下1 ml注射器时，应保持对活塞施加轻微压力，防止因真空导致注射移液管中的溶液被抽出。
6. 用矿物油抽吸微量注射器，并将其牢固连接至已填充的注射移液管。然后，用纱布小心擦去组装好的注射电极表面多余的溶液。
7. 注入极小体积的液体，直至在玻璃移液管尖端形成微小液滴，以确认尖端未堵塞。
8. 将注射电极安装到微泵系统上，并确保其固定良好。
9. 将注射电极尖端小心定位至目标坐标，并将其缓慢下降至皮层表面。
10. 使用立体定位装置，根据相应的解剖坐标将注射电极缓慢下降至目标结构（上丘）。
11. 用温热的琼脂覆盖暴露的皮层，以防止组织干燥。

4. 注射与可逆性失活

1. 将微量注射泵设置为以 40 nl/min 的速度注射 400 至 800 nl，并按下运行以开始注射。注意，注射期间放电率会有所下降。
   注意：在实验条件下，神经活动在 GABA 递送结束后一小时内恢复。可使用任何经过校准的机械装置对微量注射器施加压力并完成注射。
2. 获取电生理数据后，采用当地动物伦理委员会批准的方法实施安乐死。

结果

图 1： 注射电极组件的示意图。一个微型注射器（A）连接至记录-注射用玻璃微电极，该电极由一根30 G的皮下注射针头（B）粘附在一根银丝（C）上，并置于玻璃微管（D）内构成。圆圈标示的区域（E-F）为可能易发生泄漏的部位。

图 2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射泵（UltraMicroPump III）	WPI	#UMP3
注射控制台（Micro4 Controller）	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton 注射器	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	使用 5 至 10 μL 的注射器
凝胶型氰基丙烯酸酯粘合剂	Krazy Glue	KG86648R	凝胶形态更易于涂布在 30G 针头的针杆上
玻璃移液管	WPI	#TW100F-4	薄壁，外径 1 mm，内径 0.75 mm，带纤维的移液管
720 型针式移液管拉制仪	Kopf	720
银丝	A-M Systems, Inc.	782500	裸丝，直径 0.010"
琼脂
毛细管
皮下注射针头
芝加哥蓝（CSB）
γ-氨基丁酸（GABA）
利多卡因
阿托品滴眼液
异氟烷
加热垫
立体定位仪
#10 手术刀片
矿物油