在小鼠脑切片中通过GABA喷射记录全细胞电流

摘要

来源：Feng, Y. 等，脑片中通过喷射 GABA 诱导的全细胞电流，J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了在小鼠前额叶皮层脑片中记录由γ-氨基丁酸（GABA）诱导的全细胞电流的过程。通过精确递送GABA，可激活突触后神经元中的氯离子通道，从而产生抑制性突触后电流（IPSCs）。随着GABA浓度升高，这些IPSCs幅度增大，反映了GABA在突触传递中的抑制性作用。

方案

所有涉及动物样本的操作均经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 溶液的配制

1. 根据已发表的研究中列出的成分（见表1），配制500 mL标准人工脑脊液（ACSF）。
   1. 使用洁净的玻璃烧杯和去离子水新鲜配制ACSF溶液。用去离子水清洗药匙并干燥后，向500 mL去离子水中依次加入氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）、碳酸氢钠（NaHCO₃）、硫酸镁（MgSO₄）、D-葡萄糖，并在用95% O₂/5% CO₂混合气体预充气约20分钟后（如表1所述），再加入氯化钙（CaCl₂）。持续搅拌直至完全溶解。
   2. 确保ACSF溶液完全澄清，无任何沉淀。调节pH至7.2–7.4，并用95% O₂和5% CO₂的混合气体持续充气约20分钟。
2. 根据表2中所述化学成分，配制250 mL切片用溶液。
   1. 向250 mL去离子水中加入KCl、氯化镁（MgCl₂）、NaH₂PO₄、NaHCO₃、胆碱·Cl和D-葡萄糖，并按1.1.1步骤最后加入氯化钙（CaCl₂），溶解方法同1.1.1和1.1.2所述。
   2. 用95% O₂/5% CO₂混合气体充气后，将溶液置于冰箱中冷却15–20分钟，使切片液达到冰冻低温并部分结冰。
      注意：本实验使用该切片液制备1–2月龄小鼠的脑片；对于超过2月龄的小鼠，配方可能有所不同。
   3. 将脂多糖（LPS）溶解于无菌无热原的等渗盐水（0.9% NaCl）中，配制成LPS溶液。通过腹腔注射给予LPS（0.5 mg/kg），注射2小时后开始记录。

2. 前额叶皮层切片的制备

1. 从冷冻箱中取出切割液，混匀至呈泥状。将溶液置于冰上，并持续用95% O₂/5% CO₂气体饱和。
2. 使用大型锋利剪刀，按描述迅速将小鼠断头，立即把头部放入盛有冰冻（0–4°C）切割液的烧杯中。
3. 用精细剪刀沿中线从尾侧向鼻侧方向剪开颅骨顶部，并移除颅骨两侧部分。用精细刮勺取出脑组织，迅速投入冰冻切割液中。
   注意： 步骤2.2–2.3必须快速完成（理想情况下<1分钟）。
4. 将脑组织放置在盛有冰块的9 cm培养皿盖上。用冰冻切割液冲洗脑组织，然后用刀片切除小脑和嗅球。
5. 在振动切片机的样品台表面涂上氰基丙烯酸酯胶水。小心地将脑组织块放置在胶滴上，确保头端朝上，随后立即浸入冰冻切割液中。
6. 调节振动切片机的刀片夹持器，使其与水平面成15°角，并制备350 µm厚的冠状脑切片（刀片振动频率 = 85 Hz，切片速度 = 0.1 mm/s）。
7. 用移液器将切片转移至盛有人工脑脊液（ACSF）的恢复室中，在室温下孵育1小时，并持续用95% O₂/5% CO₂气体饱和。

3. 全细胞膜片钳记录

1. 根据拉制仪操作手册中的具体指南，制备用于记录电极或喷吹微电极的玻璃硼硅酸盐微电极。记录电极的尖端电阻范围为4-6 MΩ，喷吹微电极的尖端直径范围为2-5 µm。
2. 加入 Na⁺ 通道阻滞剂（河豚毒素（TTX），1 µM），用于阻断快速钠通道⁺ 通道，从而记录动作电位。使用蠕动泵将人工脑脊液持续以2-3 mL/min的流速灌注入记录室，并同时从记录室中吸出，以维持恒定的灌流速率。用95% O₂₂/5% CO₂₂ 持续灌注以确保脑片的活性。
3. 使用经修剪尖端以适配脑片大小的改良巴斯德移液管，将脑片转移至记录室。用带有平行尼龙丝的铂金片固定锚覆盖脑片，尼龙丝间距≥2 mm，以将脑片固定在平台上。
4. 用内液填充记录微电极表3）并用含10 µM、50 µM和100 µM γ-氨基丁酸（GABA）的人工脑脊液（ACSF）或仅含ACSF的对照溶液填充喷射微电极。
5. 为防止杂质堵塞，在将记录电极浸入ACSF之前，使用1 mL注射器施加轻微的正压。在显微镜（4倍物镜）下，利用显微操作器将记录电极和喷吹微管定位，使它们的尖端出现在显示器视频图像的中心位置图1A).
6. 调节显微镜焦距（40倍物镜），同时逐渐降低喷流微电极，将其置于记录神经元上方，角度为45°。保持喷流微电极尖端与记录神经元之间的距离在20–40 µm范围内。图1B). 缓慢而小心地将记录电极靠近神经元，然后释放正压。通过连接电极 holder 的管路施加轻微且短暂的负压，以形成吉欧姆封接。
7. 将电压维持在 0 mV。在形成吉欧姆封接后，手动或自动补偿快速和慢速电容。随后通过上述管道施加短暂而强烈的负压，以进入全细胞记录模式。
8. 在电压钳模式下记录eIPSC。使用由Master 8电压步进发生器控制的Picospritzer，向喷吹微管施加低气体压力（氮气，4–6 psi），以递送单次或成对的GABA喷吹（图2).

表1. 记录用人工脑脊液（ACSF）。

物质	g/mol	浓度 (mM)	重量 (g/L)
NaCl	58.443	119	6.9547
KCl	74.551	2.5	0.1864
NaH2PO4	137.99	1	0.1380
NaHCO3	84.007	26.2	2.2010
MgSO4	120.366	1.3	0.1565
D-glucose	198.17	11	2.1799
CaCl2	110.98	2.5	0.2775

表2. 切片切割液。

物质	g/mol	浓度 (mM)	重量 (g/L)
KCl	74.551	2.5	0.1864
MgCl2	95.211	7	0.6665
NaH2PO4	137.99	1.25	0.1725
NaHCO3	84.007	25	2.1002
Choline·Cl	139.63	115	16.0575
D-glucose	198.17	7	1.3872
CaCl2	110.98	0.5	0.0555

表3. 全细胞膜片钳记录的内液溶液。

物质	g/mol	浓度 (mM)	重量 (g/L)
Cs gluconate	328.052	100	32.8052
CsCl	168.36	5	0.8418
HEPES	238.301	10	2.3830
MgCl2	95.211	2	0.1904
CaCl2	110.98	1	0.1110
BAPTA	476.433	11	5.2408
Na2ATP	551.1	4	2.2044
Na2GTP	523.2	0.4	0.2093

结果

图1. 喷流微管与记录电极示意图。
(A) 喷流微管与记录微管之间的距离。 (B) 喷流微管（左）和记录电极（右）位于脑切片表面的位置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃硼硅酸盐微量移液管	Shutter Instruments	BF150-86-10	外径 1.50 mm；内径 0.86 mm
微量移液管拉制仪	Shutter Instruments	MODEL P-97	Flaming/Brown 微量移液管拉制仪
显微操作器	Shutter Instruments	MP-285
计算机控制放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
数字采集系统	Molecular Devices	Digidata 1440A
成像相机	Nikon	2115001	检测设备
显微镜	Nikon	Eclipse FN1
Master 8	A.M.P.I.	Master-8 脉冲刺激器
振动切片机	Leica	VT 1000S
Picospritzer	Parker Hannifin		用于细胞研究中皮升级液体喷射的压力系统
剃须刀片	Gillette	74-S	FLYING EAGLE
视频监视器	Panasonic	WV-BM 1410
502 胶水	Deli	7146	氰基丙烯酸酯胶
蠕动泵	上海佳朋科技有限公司	BT100-1F
视频摄像机	Olympus America Medical	OLY-150
移液管	Biologix	30-0138A1