建立用于小鼠视网膜扁平铺片电生理记录的全细胞膜片钳技术

摘要

来源：Tu, H., 等. 去传入小鼠视网膜平铺制备中星形无长突细胞的膜片钳记录。 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频演示了用于从小鼠视网膜平铺标本进行电生理记录的全细胞膜片钳技术。使用带有电极的细玻璃移液管接近视网膜内的星形细胞（SACs）。在形成密封后，施加负压以破裂膜并形成全细胞膜片钳构型。最后，利用该构型测量通过SAC突触受体的离子流。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 外部溶液与内部溶液

1. 在视网膜解剖过程中使用哺乳动物林格氏液，并将其作为后续电生理记录的外部溶液。在记录当天，用10倍浓缩液（不含钙）配制哺乳动物林格氏液，并在通入碳酰气（95% O₂ 和 5% CO₂）15分钟后逐滴加入CaCl₂。最终的1倍溶液成分如下（单位为 mM）：120 NaCl、5 KCl、25 NaHCO₃、0.8 Na₂HPO₄、0.1 NaH₂PO₄、2 CaCl₂、1 MgSO₄ 和 10 D-葡萄糖。
2. 使用两种内部溶液来表征SAC振荡。在成年小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的长时间全细胞膜片钳记录中测试所配制溶液的有效性，并将验证合格的溶液分装为500 µl每份，于-20 °C保存直至使用。
   1. 记录膜电位振荡时，使用含钾的内液，其成分为（单位为 mM）：125 K-葡萄糖酸盐、8 NaCl、4 三磷酸腺苷镁盐（ATP-Mg）、0.5 锂-三磷酸鸟苷（Li-GTP）、5 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、10 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和0.2% 生物胞素（w/v）。用KOH调节pH至7.3。
   2. 记录兴奋性和抑制性突触后电流时，使用含铯的内液，其成分为（单位为 mM）：100 Cs-甲磺酸盐、8 NaCl、4 ATP-Mg、0.5 Li-GTP、5 EGTA、10 HEPES 和 0.2% 生物胞素（w/v）。用CsOH调节pH至7.3。

2. 记录当天的准备工作

1. 为制备带有通孔的硝酸纤维素膜，使用由钝化的16 G注射器针头定制的打孔器手动打孔，并将膜置于两片洁净的玻璃片之间压平。对于整体视网膜样本，制作一个直径为0.2 mm的中心孔，并在其周围制作4个直径为1-1.2 mm的较大孔。
2. 为制备用于向电极内加载内液的定制反向填充细丝，将一个10 µl移液枪头在中间熔化，并轻轻拉长熔化部分，直至其冷却并硬化。使用前，用洁净的剃刀刀片修剪该细丝，使其略长于膜片钳电极。
3. 使用程序化拉制仪从带内丝的硼硅酸盐玻璃管中拉制膜片钳电极。在实验当天制作微电极并立即使用。
   注意：记录SACs时，我们采用以下拉制仪参数：加热值：484；拉力：0；速度：25；延迟时间：1；压力：400；斜坡值：462。硼硅酸盐玻璃管的外径（O.D.）和内径（I.D.）分别为1.65 mm和1.0 mm。电极阻抗为10-14 MΩ。
4. 组织取材前1小时，将一管内液置于旋涡振荡器上振荡解冻，时间不少于>30分钟。

3. 视网膜解剖

1. 使用含4%异氟烷的氧气麻醉动物，直至其对脚趾夹捏无反应。通过颈椎脱位处死动物。
2. 用直头虹膜剪在距视神经头1-2 mm处剪断两侧眼球的视神经。
3. 将眼球在干净的纸巾上滚动以去除血液，随后浸入通有碳合气的哺乳动物任氏液中。用23 G针头在角膜缘处打孔，并用显微剪沿角膜缘将眼球切成两半。用精细镊子移除角膜和晶状体。
   1. 对于视网膜铺片，用精细镊子轻轻将整个视网膜从色素上皮层剥离，并从边缘向视神经头方向做四个1.5–2 mm的正交切口。
4. 将打孔的硝酸纤维素膜浸入培养皿中，用镊子或毛笔轻轻将视网膜（节细胞层（GCL）朝上）拖过膜面。制备全铺片视网膜时，将视神经头置于中央孔中。将带有视网膜的膜转移至另一个干净的培养皿中。用细毛笔轻轻压平视网膜，使其呈马耳他十字状，并将四个边缘均覆盖在孔上。
   1. 若需分批检测视网膜部分区域，可用刀片将第3.3步制备的每个眼杯切成3–4块，保留色素上皮层附着。未使用的组织块应避光保存于通有碳合气的外部溶液中，并在12小时内使用。
5. 用一片干燥滤纸吸去硝酸纤维素膜表面液体，并用镊子和毛笔小心去除玻璃体和内界膜。
6. 在将整个装置转移至底部带有密封玻璃盖玻片的记录室之前，确保视网膜所有边缘均牢固贴附于膜上。用真空脂将膜固定在盖玻片上，并用外部溶液重新水化视网膜。注意避免装置下方困住气泡。
7. 将记录室置于直立显微镜载物台上。以约每分钟3 ml的流速，向记录室灌注温热（34–35 °C）且通有碳合气的外部溶液。
8. 先用10倍物镜观察视网膜，再使用60倍水浸物镜在微分干涉差（DIC）和/或落射荧光模式下观察节细胞层（GCL）和内核层（INL）神经元。为观察表达tdTomato的星形无长突细胞（SACs），请使用白光发光二极管（LED）光源，并配合554 nm激发滤光片和581 nm发射滤光片。

4. 视网膜平铺标本的全细胞膜片钳记录

1. 使用注射器滤器将内液过滤至定制的后填充细管中。
2. 将细丝插入新拉制的微移液管中，并在尖端附近注入内液，直至溶液覆盖银电极丝 >5 mm。将微移液管固定在带有吸力杆的电极夹持器上，通过推动或拉动与管道相连的10 ml塑料注射器的活塞，调节电极内部压力。
3. 在物镜下找到移液管，并将其下降至视网膜上方约 100 µm 处。在电流跟随模式（I = 0）下，使用直流偏移将静息直流电压信号调零。在电流钳模式下测量移液管电阻_夹钳通过移液管向浴液中注入固定振幅的方波电流，以确定接入电阻（Raccess）模式，并通过调节Raccess旋钮补偿差值。根据欧姆定律，利用Raccess旋钮上的读数计算移液管电阻。
4. 缓慢将电极移至视网膜上方约10 µm处。对电极施加正压。观察当电极接近视网膜时，移液管尖端附近反射光的变化。迅速但轻柔地将移液管推入神经节细胞层（GCL），并立即降低正压。
5. 将移液管移向标记的神经元，避免接触其他神经元、血管以及Muller细胞的终足。如需防止电极堵塞，可施加更大的正压。
6. 将移液管尖端置于标记神经元的中线附近，直至观察到凹陷。释放正压，使细胞膜回弹至移液管尖端。
7. 向移液管施加20至120 pA的负电流，以促进千兆欧姆封接的形成。必要时施加轻柔负压，使细胞膜被吸入移液管内。封接形成后等待5分钟，再进行细胞膜破裂，以便通过灌流清除溢出的胞内溶液。通过轻柔负压破裂细胞膜。
8. 膜破裂后，在电流钳模式下，打开桥式平衡，并使用 Raccess 旋钮进行调节。
   注意： 对于像SAC这样的小细胞，即使需要调整，幅度也极小。或者，可在电压钳模式下记录兴奋性和抑制性突触后电流（V_夹钳）分别将细胞钳制在氯离子的反转电位（约 -75 mV）和谷氨酸的反转电位（约 0 mV）。如有需要，检查并调整移液管位置，以补偿视网膜和/或显微操作器偶尔发生的漂移。
9. 在药理学处理前、处理期间及处理后记录膜电位或电流变化，需准备突触阻断剂（例如， 氰喹酸 [CNQX]，(2R)-氨基-5-磷酸戊酸 [AP5]，苦味毒剂 [picrotoxin]，筒箭毒碱 [tubocurarine] 等等。）和通道调节剂（例如， 氟吡汀、多巴胺、甲氯芬那酸等药物在实验当天从冷冻储备液中新鲜配制，使用碳合Ringer溶液稀释，并通过灌流以批量方式施加。
10. 记录完毕后，轻柔地将移液管从细胞体上移开。将组装结构从记录室转移至一个干净的培养皿中。将视网膜从原硝酸纤维素膜上取下，重新贴附于另一张无打孔的展平硝酸纤维素膜上，以确保固定过程中视网膜的平整性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带微分干涉相衬（DIC）的固定式显微镜	Olympus	BX51-WI
显微操作器	Sutter	MP-225
膜片钳放大器	A-M System	AM2400
模数转换器	National Instrument	NI-USB-6221
加热控制器	Warner Instrument	TC-324B
管路加热器	Warner Instrument	SC-20
蠕动泵	Rainin	Dynamax
移液管拉制仪	Sutter Instrument	P-1000
带灯丝玻璃管	King Precision Glass	定制
刺激器	A.M.P.I.	Master-8
生物胞素	Sigma	B4261
NaCl	Sigma	S6191
KCl	Sigma	P5405
NaHCO3	Fisher	BP328-1
Na2HPO4	Sigma	S0876
NaH2PO4	Sigma	S5011
CaCl2	Sigma	C5670
MgSO4	Sigma	M1880
D-葡萄糖	Sigma	G6152
K-葡糖酸盐	Sigma	G4500
ATP-Mg	Sigma	A9187
Li-GTP	Sigma	G5884
EGTA	Sigma	E0396
HEPES	Sigma	H4034
KOH	Sigma	P5958
甲磺酸铯	Sigma	C1426
CsOH	Sigma	232041
注射器滤器	Nalgene	171
1 ml 注射器	Rainin	17013002
10 µl 移液器吸头	Genesee Scientific	24-130RL
10X PBS	Lonza	17-517Q