用于评估共培养脊髓切片中神经元再生的电生理记录

摘要

来源：Heidemann, M.，等 利用多电极阵列培养的脊髓组织型共培养物研究功能再生。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了使用多电极阵列（MEA）设备记录的脊髓切片器官型共培养物的电生理信号。这些记录用于评估切片之间的神经元再生情况。观察到的同步电活动证实了神经再生的成功。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 在多电极阵列上固定脊髓组织切片

1. 在培养箱中预热无菌营养培养基（37 °C，瓶盖轻轻拧松以供氧）。
2. 使用带有橡胶尖头的无菌镊子，在室温（RT）下，于体视显微镜下将多电极阵列（MEA）放置于培养皿中，并使电极阵列处于焦点位置。在洁净、无尘且无菌的电极阵列中央滴加6 µl鸡血浆。用小刮铲小心地将两段腹侧相对的脊髓组织移入血浆液滴中。操作时避免刮铲接触电极。
3. 在鸡血浆液滴周围加入8 µl凝血酶。使用凝血酶移液枪头小心混合并均匀铺开鸡血浆/凝血酶混合物，覆盖两片组织切片。注意切勿直接接触脆性的电极阵列。在凝血发生前，吸除多余的鸡血浆/凝血酶混合物。
4. 将培养皿盖好以保持高湿度，将MEA/培养物组装体置于37 °C培养箱内的加湿环境中静置约1小时。
5. 向培养室中小心加入10 µl营养培养基，盖上培养皿盖，放回培养箱中孵育约30分钟。
6. 将每个MEA/培养组件用无菌橡胶包被的尖端放入滚瓶中，加入3 ml营养培养基，拧紧瓶盖。将滚瓶置于培养箱内的滚筒中，以1 - 2 rpm转速旋转，培养环境为5% CO₂₂含37 °C的气体环境。
7. 7天后更换一半的培养基 体外 （体外培养天数）以及之后每周1-2次。

2. 机械性损伤

1. 用无菌的橡胶包头镊子将MEA/培养组件从滚筒管中取出，放入无营养液的培养皿中，在体视显微镜下对组织进行聚焦。通过视觉确认两个组织切片已融合。
2. 用橡胶包头镊子夹住MEA，以固定MEA/培养组件。
3. 将手术刀片置于MEA的凹槽内，靠近组织切片处。持刀时保持刀片接近水平。
4. 抬起刀柄，同时使刀片保留在MEA的凹槽中，使刀片从刀根向刀尖方向“滚动”，从而切断覆盖凹槽的组织。
5. 如有必要，可用25 G针尖切断任何残留的组织连接。操作仅限于凹槽区域内，避免触碰脆弱的边缘。
6. 将MEA/培养组件放回滚筒管中。向培养物中加入3 ml新鲜营养液，并将其放回培养箱内的滚筒中。

3. 自发活动的电生理记录

1. 为研究选定 DIV 数量后两段脊髓切片之间的功能再生，将 MEA/培养组件安装在显微镜下的记录室中，并加入约 500 µl 细胞外溶液（见材料列表）。
2. 首次记录前等待 10 分钟，使系统达到稳定状态。
3. 在室温下，从 MEA 的每个可检测活动的电极连续 2 次记录基础自发活动，每次约 10 分钟。
4. 为确保稳定的细胞外环境，每次记录结束后更换细胞外溶液。
5. 为解除网络抑制，加入含有士的宁（1 μM）和加巴青（10 μM）的细胞外溶液；开始记录前至少等待 2 分钟。

4. 数据分析

注意：对于细胞外记录的动作电位检测，应使用基于标准差的检测器，并为每个电极设置后续的鉴别器。

1. 根据标准操作流程，以点阵图形式显示每个电极记录到的神经元活动（图 1F）。
2. 通过在 10 毫秒滑动窗口（以 1 毫秒步长移动）内汇总相应通道中的事件数量，确定并显示每一片段的总体网络活动（图 1G）。
3. 在每一片段中检测独立的簇状放电事件（即在多个电极上同时出现的活动簇）。为此，设定相应总体网络活动中的最小峰值活动阈值，并定义每次簇状放电的起始与终止时间。例如，合适的阈值可设为平均簇状放电幅度的 25%，簇状放电的起始可定义为至少持续 5 毫秒时间窗口内的首个事件，终止则定义为至少持续 25 毫秒时间窗口内的最后一个事件。
4. 为量化功能再生情况，计算两个片段之间同步簇状放电事件的百分比。为此，计算一个片段中簇状放电与其后另一片段中簇状放电之间的潜伏期。
   注意：当潜伏期小于平均簇状放电持续时间时，该对簇状放电被视为“同步”。尤其在活动频繁的共培养体系中，两侧可能在选定的潜伏期窗口内偶然同时启动簇状放电，这一因素在计算同步簇状放电百分比时必须予以考虑。

结果

图1. 自发性活动的显示与分析。 （A）微电极阵列（MEA）示意图。铂覆盖的电极以黑色表示，透明导线为红色，MEA中央的沟槽为黄色。（B）位于MEA中心的电极阵列局部放大图。（C）培养8天（DIV）的明场图像。组织切片已沿相对的侧面生长并融合。黄色条带代表MEA上无电极和绝缘层的沟槽。比例尺 = 400 µm。（D）实验时间线。将E14大鼠胚胎的两个脊髓切片并排置于MEA上。数天内，切片沿相对侧面生长并融合。在培养8至28天（DIV）期间，通过融合部位进行完全损伤。两周至三周后，记录自发性活动，并对培养物进行固定以进行免疫组织化学染色。（E）23天（DIV）培养物每个单独电极记录的自发性活动轨迹。为更清晰地展示，仅显示每隔一条的轨迹。橙色轨迹代表来自右...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平面多电极阵列	Qwane Biosciences		根据本实验室设计定制
营养培养基			配制 100 ml
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	31966-021	80 ml
马血清	Gibco	26050-070	10 ml
蒸馏灭菌水			10 ml
神经生长因子-7S [5 ng/mL]	Sigma-Aldrich	N0513	200 µl
			用含 1% BSA 的洗涤液重悬
细胞外基质凝胶	BD Biosciences	356230	必须始终保持低温；用适用于产前及胚胎神经元的优化培养基以 1:50 比例稀释
细胞外溶液 (pH 7.4)			[mM]
NaCl			145
KCl			4
MgCl₂			1
CaCl₂			2
HEPES			5
Na-丙酮酸盐			2
葡萄糖			5
加巴青	Sigma-Aldrich	SR-95531
微量移液管	World Precision Instruments, Inc.	MF28G-5
士的宁	Sigma-Aldrich	S0532	有毒
组织培养平管 10（即滚管）	Techno Plastic Products AG	91243