一维图案化神经元培养物的外部激发

摘要

来源：Stern, S., 等 在二维和一维培养体系中利用电场和磁场对外部神经元进行刺激。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了一种利用均匀、单向电场刺激条纹状神经元培养物的技术。

方案

1. 使用荧光染料对神经元培养物中的自发或诱发活动进行成像。

1. 将50 µg钙离子敏感型荧光染料（参见材料/试剂表）溶解于50 µL DMSO（二甲基亚砜）中，配制成溶液。
2. 配制细胞外记录液（EM），其中包含（单位：mM）10 HEPES、4 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、139 NaCl、10 D-葡萄糖、45 蔗糖（pH 7.4）。
3. 将神经元培养物与2 mL EM及8 µL钙离子敏感型荧光染料溶液共同孵育1小时。避光并轻轻旋转，以确保染料均匀分布于细胞中。
4. 成像前更换为新鲜的EM溶液。荧光成像结果如图1所示。
5. 使用配备钙离子荧光成像光学滤光片（激发峰488 nm，发射峰520 nm）的荧光显微镜进行成像，并采用具备定量分析功能的相机和软件，对显微镜视野内任意感兴趣区域（ROI）的荧光强度进行定量。

2. 培养物的电刺激

注意：电刺激的基本装置如图2所示。将培养约14天的神经元细胞的盖玻片置于培养皿中，并放置在荧光显微镜下。通过施加于培养区域外侧的两对浴电极施加电压，同时使用钙离子敏感性染料对神经元的电活动进行成像。电极由信号发生器驱动，其输出信号经双通道放大器放大。相较于更常用的电流控制，优先采用电压控制进行刺激，因为电压控制可直接确定电场矢量，从而实现简单的矢量叠加与组合。但这需要仔细检查电场的均匀性，在电压控制条件下可对整个样品进行均匀性验证。使用电压控制时，应注意避免接地回路，并应验证电场的均一性。

1. 使用一对平行电极丝进行具有均匀电场的电刺激。
   1. 使用铂金制成的电极，其直径约为 0.005''（127 µm）。当与 13 mm 盖玻片配合使用时，确保两个电极之间的距离约为 11 mm，并将电极置于培养物上方 1 mm 处。
      ​注意： 制作电极支架 (图 3A) 时，使用聚四氟乙烯（PTFE）。在 PTFE 上钻出细孔以插入电极。该装置应高于细胞外溶液，以确保电极暴露的顶端部分不会与溶液接触。为防止导电，对可能暴露的电极引线部分使用环氧胶进行绝缘。
   2. 采用占空比为 50% 的方波脉冲，且无直流分量，以避免发生电解。通过调节脉冲持续时间在 10 µs 至 4 ms 之间，实现有效刺激的同时避免灼伤培养物。确保脉冲幅度约为 ±22 V（见 图 3）。可通过连接在电极两端的示波器观察方波脉冲。
      注意： 为便于编程任意所需波形，可使用商用波形编辑软件（参见材料列表）。通过图形界面输入所需波形，并将其发送至波形发生器。
2. 使用探针电极检测电场均匀性。使用至少 1 mm × 1 mm 的网格，以便在电极之间移动探针并测量电势。
   1. 测量电势。使用 计算电场强度。将其中一个电极用作参考电极。在脉冲持续时间从 100 µs 到 4 ms 范围内变化时测量电场（见 图 3B 中 100 µs 脉冲持续时间的示例），以验证在刺激持续时间范围内电场的均匀性。
      注意： 当脉冲持续时间为 1 ms 时，电场均匀性的实测结果示例见 图 3D。

结果

图1：同步神经网络爆发期间成像的钙瞬变示例轨迹。A. 实验前用钙离子染料染色的神经元图像。B. A图中各感兴趣区域（ROI）的强度随时间变化轨迹，轨迹颜色对应A图中ROI边框的颜色。三个ROI内强度同步大幅上升，代表一次网络爆发[插入图2]

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钙，1M	Fluka	21098	细胞外记录溶液。
D-(+)-葡萄糖，1M	Sigma-Aldrich	65146	铺板培养基，细胞外记录溶液。
HEPES，1M	Sigma-Aldrich	H0887	细胞外记录溶液。
KCl，3M	Merck	1049361000	细胞外记录溶液。
氯化镁，1M	Sigma-Aldrich	M1028	细胞外记录溶液。
NaCl，4M	Bio-Lab	19030591	细胞外记录溶液。
蔗糖，1M	Sigma-Aldrich	S1888	细胞外记录溶液。
电极导线	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	神经元培养物的电刺激。
信号发生器	BKPrecision	4079	电信号的波形调节。
放大器	自制		将信号发生器输出的信号电压放大后传递至电极。
电源	Matrix	MPS-3005 LK-3	溅射设备的电源供应。
铂丝，直径0.005''；A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	神经元培养物的电刺激。