磁刺激模式化神经元培养物

摘要

来源：Stern, S., 等，在二维和一维培养体系中利用电场和磁场对外部神经元进行刺激。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了一种利用时变磁场刺激生长在盖玻片上环形图案化区域的神经元培养物的方法。

方案

1. 一维培养用盖玻片的准备。

1. 将玻璃盖玻片浸入碱性piranha溶液中进行清洗，该溶液由75 mL去离子水、25 mL 25%氨溶液和25 mL 30%过氧化氢组成。将溶液连同玻璃盖玻片置于加热板上，于约50°C条件下加热30分钟，随后用氮气吹干盖玻片。
2. 首先，采用蒸镀或溅射沉积方法，在盖玻片上先镀一层6 Å厚的铬膜（纯度99.999%），再镀一层30 Å厚的金膜（纯度99.999%）。
   1. 使用配备两个电子束源、抽速为260 l/s、靶材尺寸分别为2英寸和4英寸的溅射设备，调节至溅射速率为0.05 – 1 Å/s。使用可调转速为0至100转/分钟（RPM）的旋转台。采用0至750瓦特的直流（DC）溅射功率。
   2. 在腔室内通入纯度为99.999%的氩气，使等离子体压力达到10 mTorr，并将样品台以30 rpm转速旋转。
   3. 铬层溅射时，将溅射枪电源设定为40 W直流功率，获得约0.12 Å/s的沉积速率；金层溅射时，设定为10 W直流功率，获得约0.28 Å/s的沉积速率。
3. 将0.1 g 1-十八烷硫醇溶于100 mL ABS AR级乙醇中，超声处理30分钟。将镀有Cr-Au的盖玻片浸入该溶液中2小时，随后用ABS AR级乙醇冲洗，并用氮气吹干。
4. 取100 mL杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）与3.5 g三嵌段共聚物（见材料/试剂表）混合，以600 – 700 rpm搅拌1 – 2小时。将盖玻片浸入该溶液中1小时，随后用氮气吹干。
5. 通过划刻生物排斥层，机械蚀刻出所需图案。使用绘图笔式绘图仪，将笔替换为蚀刻针头，在金属层上划刻至底层玻璃暴露。通过计算机控制该过程，以精确复制所需图案。该工艺形成的图案如图1和图2所示。
6. 配制生物相容性溶液：100 mL D-PBS、3.5 g三嵌段共聚物、35.7 µL/mL纤连蛋白和29 µL/mL层粘连蛋白。
   1. 将盖玻片在紫外线下灭菌至少10分钟。将盖玻片在上述制备的生物相容性溶液中过夜孵育。
      ​注意：生物相容性层仅在上一步中生物排斥层被蚀刻去除的区域形成。
   2. 次日，用P-DBS洗涤盖玻片两次，随后在PM培养基中过夜孵育。此时盖玻片已可用于细胞接种。

2. 神经元培养物的维持。

1. 配制更换培养基（CM），每毫升成分为：0.9 mL MEM+3G，0.1 mL 热灭活马血清（HI HS），10 µL 100倍浓度的5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR）与尿苷混合液。
2. 配制终末培养基（FM），每毫升成分为：0.9 mL MEM+3G 和 0.1 mL HI HS。
3. 4天后用1-1.5 mL CM替换PM 体外 （体外培养天数，DIV）。在6 DIV时，更换50%的条件培养基（CM）为新鲜CM。在8 DIV时，将培养基更换为1.5 mL新鲜培养基（FM），之后每2天更换50%的FM。约一周后，出现自发性同步活动。

3. 使用荧光染料对神经元培养物中的自发或诱发活动进行成像。

1. 将50 µg钙离子敏感型荧光染料（参见材料/试剂表）溶解于50 µL DMSO（二甲基亚砜）中，配制成溶液。
2. 配制细胞外记录液（EM），其成分（单位为mM）如下：10 HEPES、4 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、139 NaCl、10 D-葡萄糖、45 蔗糖（pH 7.4）。
3. 将神经元培养物与2 mL EM及8 µL钙离子敏感型荧光染料溶液共同孵育1小时。避光并轻轻旋转，以确保染料均匀分布于细胞中。
4. 成像前更换为新鲜的EM溶液。荧光成像过程如图3所示。
5. 使用配备钙离子荧光成像光学滤光片（激发峰位于488 nm，发射峰位于520 nm）的荧光显微镜进行成像，并采用具备量化显微镜视野内任意感兴趣区域（ROI）荧光强度能力的相机和软件。

4. 培养物的磁刺激

注意：磁刺激的基本设置如图1所示。右上方为用于成像神经元中钙敏感染料的倒置荧光显微镜。磁线圈（蓝色圆圈）位于神经元环形培养（蓝色轮廓）上方约5 mm处，呈同心排列。位于培养皿边缘的感应线圈（红色圆圈）用于监测磁脉冲所诱导的电压。左上方显示的是磁刺激器（MS）线圈在电容器电压负载为5,000 kV时，通过感应线圈积分测得的动力学曲线。绿色曲线表示诱导电场（按14 mm环半径计算），蓝色曲线表示磁场。下方为神经元培养的图像。左下角为24 mm盖玻片上图案化结构的明场图像，白色区域为神经元。所拍摄的图案由不同半径的同心环形培养组成。右下角为环形结构某一小段的放大图像，显示单个神经元。作为比例参考，环的宽度约为200 µm。

1. 将神经元培养在环形图案（如1.5节所述进行蚀刻）中，用于一维培养刺激。使用钙离子敏感性荧光染料对呈一维图案排列的神经元进行钙成像（如第3节所述），该一维培养结构位于薄（170 µm）、长（10 mm）的直线上。
   1. 使用一个环形磁线圈，并将培养皿置于线圈下方约5 mm处，且与线圈同心。采用自制线圈，其内径约为30 mm（外径46 mm），电感为 L = 90 mH，由一台自制或商用的磁刺激器（MS）驱动，输入最大电压为5 kV。
   2. 为实现对神经元培养物的磁刺激，需通过高电流高电压开关将高电压和大电流放电至导电线圈中。磁刺激器（MS）可利用容量约为100 mF的大电容器构建，以获得1–5 kV的高电压。或者，使用市售的磁刺激器（见材料/试剂表）。
      注意：使用厚度为0.254 mm、宽度为6.35 mm的聚酯涂层矩形铜线制作自制线圈。将导线缠绕在定制的骨架上，骨架以玻璃纤维绝缘，并用环氧树脂封装（见材料/试剂表）。或者使用市售线圈（见材料/试剂表）。

结果

图1：用于神经元培养物磁刺激的装置示意图。A. 上图显示了磁线圈（蓝色圆圈），其位于放置在培养皿（蓝色轮廓）中的神经元环状培养物上方5 mm处，呈同心排列。位于培养皿周缘的拾取线圈（红色圆圈）用于测量磁脉冲感应的电压。下图显示了通过拾取线圈积分测得的磁刺激器线圈的动力学特性（使用5,000 kV的MS电容电压负载）。感应电场（按14 mm环半径计算）以绿色表示，磁场以蓝色表示。B. 倒置显微镜成像神经元对磁脉冲反应时钙瞬变敏感的荧光染料。C. 在同心环图案上生长的神经元，用于通过环形磁刺激器进行有效刺激。D. 在图案的一条线上生长的神经元的明场显微镜图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	细胞外记录溶液
D-(+)-葡萄糖, 1M	Sigma-Aldrich	65146	铺板培养基, 细胞外记录溶液
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	细胞培养
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F1141	生物包被
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	自发或诱发活动的成像
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	更换培养基
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1272	铺板培养基, 更换培养基, 最终培养基
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	细胞外记录溶液
HI HS	BI	04-124-1A	铺板培养基, 更换培养基, 最终培养基
KCl, 3M	Merck	1049361000	细胞外记录溶液
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	生物包被
MEM x 1	Gibco	21090-022	铺板培养基, 更换培养基, 最终培养基
氯化镁, 1M	Sigma-Aldrich	M1028	细胞外记录溶液
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	细胞外记录溶液
十八烷硫醇	Sigma-Aldrich	1858	清洗镀铬-金的盖玻片（一维培养）
蔗糖, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	细胞外记录溶液
尿苷	Sigma-Aldrich	U3750	更换培养基
溅射仪	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	在玻璃表面镀金属薄膜
绘图仪	Hewlett Packard	HP 7475A	在镀膜盖玻片上蚀刻图案
电源	Matrix	MPS-3005 LK-3	为溅射仪供电
环氧树脂	Cognis	Versamid 140	自制线圈的浇铸
环氧树脂	Shell	EPON 815	自制线圈的浇铸