利用多电极阵列测量三维共培养球体中的突触生理学

摘要

来源：Cvetkovic, C.，等。利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了使用多电极阵列（MEA）在三维共培养球体中测量突触生理学的实验步骤。该方法有助于理解三维球体内的神经网络动态以及突触网络簇状放电活动。

方案

使用多电极阵列（MEAs）测量活体突触生理活动

1. 准备用于细胞培养的多电极阵列（MEA）。

1. 用1 mL去污剂清洁每块MEA表面，持续1小时。用无菌去离子水（DI水）冲洗，再用70%乙醇冲洗以灭菌，然后在生物安全柜中紫外光下风干。
   注意：MEA可在无菌条件下保存于4 °C的去离子水中，直至使用。
2. 将50 mg多聚鸟氨酸（PLO）溶于100 mL硼酸缓冲液中，配制成0.5 mg/mL的PLO溶液。每块MEA表面加入1 mL PLO溶液进行包被，使其具有亲水性，并在37 °C孵育至少4小时。去除PLO溶液后，用去离子水清洗表面。
3. 用基础培养基（DMEM/F12）稀释细胞外基质（ECM）包被液，配制浓度为1 mg/mL的储备液。工作液的配制方法为：将3 mL ECM储备液重悬于33 mL预冷的DMEM/F12培养基中，终体积为36 mL，终浓度为80 µg/mL。
4. 每块MEA中加入1 mL ECM工作液，在37 °C孵育至少4小时。
5. 去除ECM溶液，将类球体置于1.5 mL培养基中并放置于MEA表面，确保类球体位于电极阵列上方（图1A、1A'）。静置培养2天使培养基充分附着。每2–3天更换一半培养基（必要时可更频繁），注意避免扰动类球体。
   注意：添加生长因子可能有助于提高培养物的存活率和成熟度。

2. 测量神经球的电活动。

1. 设置带有温度控制头级的多电极阵列（MEA）系统。创建一个软件程序，配置5 Hz高通滤波器、200 Hz低通滤波器，以及5倍标准差（SD）的尖峰阈值。
2. 将MEA放置于头级上，记录自发性电活动（图1B，B'）。保存原始数据，包括尖峰频率和振幅，用于统计分析。
   注意：可根据需要在MEA系统中使用灌流装置，以添加药理学试剂，或在长期记录期间增加新鲜培养基的流动。如有需要，可对尖峰信号进行额外的后期处理。

结果

图1：神经球在多电极阵列（MEAs）上的代表性活体突触生理学特征。（A, A'）利用MEAs测量神经球的活体突触生理活动。iNeurons（A）或iNeurons与hAstros共培养物（A'）可在模拟细胞外基质的底物上接种于MEA表面（见步骤4.1）。（B, B'）在记录时间窗内（横轴），所有电极（纵轴）上测得的代表性自发性电活动的点阵图。在神经生理学基础培养基中培养4周后，iNeurons神经球（B）表现出自发性尖峰放电，而共培养神经球（B'）则显示出增强的同步放电网络簇状活动（橙色箭头）。（C, C'）从代表性电极在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Thermofisher	10565-042	含 GlutaMAX 添加剂
Anti/anti	Thermofisher	15240062
B27	Thermofisher	17504044	培养基添加剂
肝素	Sigma	H3149-50KU	工作浓度：2 mg/mL
Matrigel 基底膜基质	Corning	354230	细胞外基质包被溶液。工作浓度：80 µg/mL。需在冰上配制，并确保移液器、离心管和培养基预先冷却。
MEA 2100 系统	Multichannel Systems	MEA2100
N2	Thermofisher	17502048	培养基添加剂
多聚-L-鸟氨酸（PLO）	Sigma	P3655-100MG	工作浓度：0.5 mg/mL