分析转基因斑马鱼幼虫中由猎物引发的神经元活动

摘要

来源：Muto, A. 等，利用双光子激光消融神经元群体并结合钙成像与斑马鱼幼鱼行为记录进行评估。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用基于钙离子指示剂的荧光成像方法研究转基因斑马鱼幼鱼视觉捕食探测的技术，其实现方式为使其神经元表达荧光钙离子指示剂复合物。

方案

1. 使用双光子激光显微镜消融特定神经元亚群

注意：如果用户计划在消融后进行钙成像，请使用 UAShspzGCaMP6s 品系；如果用户计划在消融后进行行为记录，请使用 UAS:EGFP 品系，因为对 EGFP 阳性细胞的消融操作比对表达 GCaMP6s 的细胞更容易。

1. 首先建立携带Gal4的果蝇品系与UAS:EGFP或UAShspzGCaMP6s品系的杂交，以标记待研究的特定神经元。务必使用 珍珠层 父母双方的背景，以便 珍珠层 可获得纯合子。
   注意： 纯合子 珍珠层 体表不含黑色素细胞（图1B在本研究中，使用了标记顶盖的 Gal4 品系 gSAIzGFFM119B 和标记间脑后部的 Gal4 品系 hspGFFDMC76A。
2. 在设置交配后的第二天，收集斑马鱼卵，并将其培育至幼体阶段，此时目标神经元将表达荧光报告基因。
3. 将斑马鱼幼鱼固定在2%低熔点琼脂糖中（图1B).
   1. 首先制备2%琼脂糖储备溶液：将2 g低熔点琼脂糖粉末加入100 mL系统用水（即用于在循环水系统中饲养成年斑马鱼的水）或E3水中，通过微波加热至沸腾，并剧烈搅拌使其溶解。
   2. 将2%低熔点琼脂糖储备液微波加热至沸腾。取3.5–4.0 mL琼脂糖溶液倒入6 cm培养皿的皿盖中。待琼脂糖冷却至触感温热后，再进行后续操作。
   3. 接下来，将一条幼虫（此步骤无需麻醉）放入琼脂糖中。使用解剖针不断调整幼虫的位置和方向，使其保持直立状态。图1C），直至琼脂糖凝固，以确保幼虫处于正确位置。
      注意： 幼虫将在琼脂糖凝固过程中继续游动。
   4. 幼虫定位后，静置5分钟，使琼脂糖完全凝固。
   5. 在琼脂糖上加入5 mL三卡因溶液（0.4%，1x工作浓度）。
      注意： 为避免幼虫在激光消融过程中移动，必须在整个消融过程中保持幼虫处于麻醉状态。
4. 使用双光子激光显微镜系统的漂白功能消融幼虫。
   1. 将琼脂糖包埋的幼虫置于双光子激光扫描显微镜下，启动显微成像系统。
   2. 启动图像采集软件，点击“激光”选项卡中的“On”按钮以打开激光器（图1D）。等待激光器的“状态”从“忙碌”变为“锁模”。
   3. 在“通道”选项卡中，将激光波长设置为 880 nm（最大功率：约 2,300 mW）以进行 EGFP 消融，或设置为 800 nm（最大功率：约 2,600 mW）以进行 GCaMP 消融。
   4. 选择20倍物镜，通过手动旋转物镜转盘进行切换。点击“Locate”选项卡，点击“GFP”以改变光学路径，直接通过目镜观察荧光。
   5. 将斑马鱼幼鱼脑部置于视野中央，然后点击“Acquisition”选项卡返回双光子显微镜。
   6. 作为消融前状态的记录，使用20倍物镜以快速扫描模式采集z轴层扫图像（以避免热损伤）。随后将消融前与消融后实验所获得的图像进行对比。图 2A). 要获取Z轴层扫图像，点击“Z-Stack”以选择Z轴层扫选项并展开该选项卡。聚焦于幼虫脑腹侧末端后，设置下限（点击“Set First”按钮）；聚焦于脑背侧最表面后，设置上限（点击“Set Last”按钮）。随后，点击“Start Experiment”按钮以开始Z轴层扫图像采集。
   7. 通过手动旋转物镜转盘，选择63倍物镜。
   8. 单击“定位”选项卡以切换至落射荧光显微镜，通过肉眼观察将待消融的细胞移至视野中央，然后单击“采集”选项卡返回激光扫描显微镜。
5. 在“采集模式”选项卡中，将“帧大小”设置为 256 × 256。点击“实时”并观察目标神经元。
6. 从背侧最上方开始，找到一个焦平面，使待消融的细胞处于清晰对焦状态。
7. 使用“区域”功能，在每个神经元上标记一个直径约为细胞大小三分之一的小圆形区域作为感兴趣区域（ROI）。
8. 将扫描速度设置为13.93秒/256×256像素（134.42 µm × 134.42 µm），对应激光驻留时间约为200 µs/像素，或200 µs/0.5 µm。同时设置4次重复（“迭代周期：4”）。或者，可优化迭代次数和扫描速度，以确保实现充分的消融。
9. 使用软件中的“漂白”功能进行消融，并结合“时间序列（2个周期）”对样品进行成像（消融前后）以及“区域”功能（用于设置感兴趣区域，ROI）或所用软件中的等效功能图1D).
10. 通过比较时间序列循环中的第一幅图像（消融前）和第二幅图像（消融后），确保在漂白后，靶向细胞中的荧光降低至与背景水平相当的强度图2B).
11. 如果消融后仍存在荧光，则增加迭代次数。
12. 接下来，将焦平面略微调深一些（即，朝向腹侧），并选择下一个出现未消融细胞的焦平面。
13. 按照上述方法执行漂白操作（步骤1.9）。重复这些步骤，直至目标神经结构中的所有细胞均被消融。
14. 在扫描完覆盖待消融神经结构的所有焦平面后，检查细胞的荧光是否已消失。若发现部分细胞因消融不充分仍具有荧光，应按照上述方法再次进行激光照射。
15. 若需在激光照射后从琼脂糖中回收幼虫，请勿强行将其挤出琼脂糖，以免损伤幼虫。相反，应小心地在幼虫周围垂直于其体表方向对琼脂糖进行微小切割。随后，等待麻醉效果消退后幼虫自行游出琼脂糖。
16. 继续对下一个幼虫进行消融，或使用与所研究行为无关的另一群神经元进行对照实验。
    注意： 此处作为对照，采用上述相同方案，利用激光消融了UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B幼虫中的嗅球神经元图2A，右侧。
17. 在进行钙成像（第2节）或行为记录（第3节）之前，需让样本恢复数小时至1天。在此恢复期间，应检查幼虫的健康状况即，正常自发游泳，消融区域周围无明显热损伤， 等等。）并剔除显示任何健康不良迹象的幼虫。

2. 钙成像记录视顶盖切除斑马鱼幼虫中由猎物引发的神经元活动

1. 准备记录室时，将一个带粘性的密封封接杂交室垫圈置于载玻片上，粘性面朝向载玻片，并揭去顶部密封膜。
   注意： 这形成了一个直径为9 mm、深度为0.8 mm的小型记录腔室（图3A).
2. 接下来，将一张尼龙网（孔径：32 µm）放置在底部已剪开的50 mL离心管上，使用管盖将网固定在管口（图3B).
3. 制备 草履虫 （即用作幼虫视觉刺激的猎物）。
   注意： 制备 草履虫 培养（步骤 2.3.1 和 2.3.2） beforehand。
   1. 获取 草履虫 提前从商业来源或学术生物资源中心获取种子培养物。
   2. 培养 草履虫 在含有经高压灭菌的稻草和一粒干啤酒酵母的水中培养数天图3C).
   3. 倒入 草履虫 依次通过两层筛网（第一层孔径为150 µm，第二层孔径为75 µm）过滤培养物，以去除培养物中的碎片。
   4. 收集 草履虫 在上一步的流穿液中使用尼龙网膜（13-µm 孔径）进行过滤。
   5. 重悬 草履虫 使用系统水冲洗尼龙网，将内容物转移至玻璃烧杯中（使用洗瓶）图3D).
4. 冲洗滤网（图3B) 在系统水中清洗 2 次图3E).
   注意： 此步骤的目的是去除可能含有的任何气味物质和味觉物质 草履虫 培养基，因为本研究的目的是观察视觉驱动的神经元活动。
5. 将斑马鱼幼鱼放入三卡因溶液中以进行麻醉。
6. 将单个幼虫置于2%低熔点琼脂糖中进行固定。
   1. 首先，将2%低熔点琼脂糖进行微波加热，然后向琼脂糖中加入1/10体积的10倍浓缩三卡因（tricaine）。
   2. 将一滴含有三卡因的琼脂糖置于记录室中（图3A).
   3. 在确认琼脂糖温度不过高后，将麻醉后的幼虫（来自步骤2.5）放入琼脂糖中，并立即去除多余的琼脂糖，使琼脂糖表面呈轻微凸起状。
   4. 用解剖针迅速将幼虫调整至直立位置（图1C).
      注意： 这些步骤必须在几秒内完成，以免琼脂糖凝固。
   5. 幼虫正确放置后，静置5分钟，使琼脂糖完全凝固。然后，在琼脂糖上滴加一滴1×三卡因溶液。
7. 移除斑马鱼幼鱼头部周围的琼脂糖，并留出空间以 草履虫 使用手术刀在琼脂糖中进行划线。操作时，首先在琼脂糖上做几个小切口（图3F然后，轻轻将系统水倒入培养室，以小心去除多余的琼脂糖。
   注意： 在此步骤中，将洗去三卡因。
8. 接下来，放入一个 草履虫 在记录室中作为视觉刺激。
   注意： 当 草履虫 靠近斑马鱼幼鱼头部游动时，会引发神经元反应（图3G).
9. 将记录室置于配备科学级CMOS相机的落射荧光显微镜下图 3H）并选择 2.5X 物镜（图3I).
10. 采集GCaMP荧光信号的时间序列记录。
    1. 启动配备相机的图像采集应用程序。
    2. 单击“序列窗格”，在窗格中选择“硬盘记录”。在扫描设置部分，将“帧数”设置为900或所需的其他总帧数。
       注意： 如果具备条件，使用带有可高效将数据保存至硬盘的模块（此处为“Hard Disk Record”）的延时录像软件。
    3. 在“捕获”窗格中，将曝光时间设置为 30-ms（即，33.3 帧/秒），以及 2 x 2 合并像素
    4. 在显微镜控制触摸面板上，选择用于GFP的滤光片组，因为GCaMP的激发/发射光谱与GFP相似。
    5. 在“捕获”面板中点击“实时”以在相机视野中找到幼虫并进行聚焦（图 4A），然后单击“Stop Live”，再单击“Start”按钮。将视频保存为 .cxd 格式或任何其他包含采集条件信息的格式。

结果

图1. 斑马鱼幼体。（A） 5天龄（受精后5天（5-dpf））斑马鱼幼体及其猎物草履虫。（B） 包埋于2%低熔点琼脂糖中的4-dpf nacre幼体。请注意，nacre品系体表缺乏黑色素，但视网膜色素上皮保持完整。比例尺：0.5 mm。（C） 用于在琼脂糖中调整斑马鱼幼体方向的解剖针。比例尺：1 cm。（D） 双光子显微镜所用软件的截图，显示了在消融实验中使用的“漂白”、“时间序列”和“区域”面板。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NuSieve GTG 琼脂糖	Lonza	Cat.#50080	低熔点琼脂糖
6 cm 培养皿	FALCON	Product#:351007
解剖针	AS ONE Corporation	Cat. No. 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Carl Zeiss		双光子激光扫描显微镜
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63倍物镜
Imager.Z1	Carl Zeiss		落射荧光显微镜
ZEN	Carl Zeiss		共聚焦显微镜图像采集软件
Secure-Seal 杂交腔室垫圈，8 个腔室，直径 9 mm × 深度 0.8 mm	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	用于钙成像中的记录腔室
手术刀	MANI	Ophthalmic knife MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	model:C11440-22CU	科学级 CMOS 相机
HCImage	Hamamatsu Photonics		图像采集软件
硬盘记录模块	Hamamatsu Photonics		可快速将视频文件保存至硬盘驱动器的软件模块
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	Product No. GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS 相机
XIMEA xiQ 相机	XIMEA	Product No. MQ042RG-CM	CMOS 相机
环形 LED 光源	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	白色 LED
尼龙网 32µm	Tokyo Screen	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
尼龙网 13µm	Tokyo Screen	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
金属筛网 150 微米孔径	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
金属筛网 75 微米孔径	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd.		干啤酒酵母
LabVIEW	National Instruments		集成化编程开发环境
Mai-Tai HP	Spectra Physics		双光子激光器