使用全细胞膜片钳研究荧光神经元的兴奋性

摘要

来源:Briz， CG 等人，在子宫电穿孔方法中研究神经元亚群的兴奋性和单细胞连接。 J. Vis. Exp.（2017 年）

该视频演示了一种使用全细胞膜片电流钳研究表达荧光蛋白的神经元细胞的兴奋性的方法。在电流钳模式下，产生指示神经元兴奋性的动作电位。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 电生理学

注意:该协议的目标是从 GFP 电穿孔小鼠大脑（或任何其他先前电穿孔的荧光蛋白）中通过 GFP 表达视觉识别的 II/III 层锥体细胞神经元获得全细胞电流钳记录。使用该协议，可以研究 IUE 引入的基因修饰对神经元电特性的影响。特定放电模式的获得是一个逐渐的分化过程，涉及广泛的离子通道的动态表达，并导致在出生后晚期之前表达瞬态放电模式。例如，在 P16 之前的体感小鼠皮层的 II/III 层中未观察到成熟的电反应。

1. 急性切片的先决条件
   1. 使用含有 119 mM NaCl、26 mM NaHCO₃、11 mM 葡萄糖、2.5 mM KCl、1.2 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂ 和 1 mM NaH₂PO₄ 的高纯度（双蒸水）制备 1 L ACSF。用 HCl 或 NaOH 将 pH 值滴定至 7.3 - 7.4。将渗透压调整为 290 mOsm。
   2. 使用特氟龙管 （~ 1 mm） 将含碳素 （95% O₂/5% CO₂） 的 ACSF 泡 15 - 20 分钟，以将 pH 值稳定至 7.3 - 7.4。
2. 全细胞记录的先决条件
   1. 确保电生理站配备有记录室、灌注系统、显微镜、电极（记录、刺激和接地）、宏观和微观纵器、刚性抗振桌面和法拉第笼、刺激器、放大器和模数 （A/D） 转换器、带有采集软件的计算机和用于分析转基因神经元的 GFP（或任何其他荧光染料）过滤器（图 1A）。
   2. 制备细胞内溶液，含有 115 mM 葡萄糖酸钾、2 mM MgCl₂、10 mM HEPES、20 mM KCl、4 mM Na₂ATP 和 0.3 mM Na₃GTP，通过 KOH 调节至 pH 7.2，通过 KCl 调节至 290 mOsm。
   3. 通过拉动硼硅酸盐玻璃毛细管制作补片移液器。使用微量移液器拉拔器准备贴片电极。使用硼硅酸盐毛细管（1.5 mm 外径，0.86 mm 内径，10 cm 长）。当充满细胞内溶液时，制作显示电阻为 3-10 MΩ 的贴片电极。
   4. 用 ACSF 以 2 mL/min 的速率灌注记录室。将记录室的温度保持在约 33 °C。
3. 全细胞记录
   1. 使用巴斯德移液管（切掉长尖端）或小刷子将切片转移到记录室中。用竖琴按住切片。以 2 mL/min 的速率用 ACSF 不断灌注切片。
   2. 修补 GFP 阳性神经元。
      1. 将切片放入记录室中，并通过显微镜以低放大倍率 （10X） 找到感兴趣的区域。然后，使用 60 倍物镜找到要修补的 GFP 阳性细胞。
      2. 用细胞内溶液填充记录电极。使用连接到过滤器（4 毫米过滤器）和微型加载器尖端的注射器，用细胞内溶液填充记录电极。
      3. 将玻璃移液器放入移液器架中。将移液器吸头放入浴槽中，并聚焦在吸头上。移液器放入浴槽后，通过背压控制系统施加正压。
      4. 修补荧光神经元（图 1B）。
         1. 在视觉引导下接近感兴趣的细胞，同时保持移液器中的背压。当细胞表面出现一个小酒窝时，释放压力。此时，可能会形成紧密的密封（电阻大于 1 GΩ）。否则，施加轻微的负压（抽吸）以促进它。
         2. 在形成密封时，将保持电压钳置于 -60 mV。一旦形成 GΩ 密封，施加吸力脉冲以破坏移液管下方的细胞膜并进入全细胞模式。
      5. 使用 current-clamp 条件记录活动。进入全电池模式后，从电压钳模式切换到电流钳模式并开始记录。例如，要记录细胞兴奋性，应用 500 ms 长的去极化电流注射 （100 - 400 pA）。
         1. 通过绘制沿序列增加输入电流的动作电位数量来计算发射速率。
            注意: 静息膜电位、输入电阻和膜电容也可以从记录中计算出来。

结果

图 1.电生理学设置和放电反应示例。A. 照片显示了用于急性切片膜片钳实验的电生理学设置。该装置包含在法拉第笼中以消除噪音，设备位于防振台顶部。左侧是电极的电动显微纵器的控制器。B. 用 GFP 电穿孔的小鼠锥体神经元，在明场和绿色荧光条件下观察。连接到 GFP + 细胞的记录移液器很明显。比例尺 = 10 μm。CAG-GFP 电穿孔对照层 II-III 神经元的放电模式显示典型的规则尖峰反应。动作电位的分布近似于沿输入电流持续时间（X 轴）的规则分布。

材料