使用全细胞膜片钳技术研究荧光标记神经元的兴奋性

摘要

来源：Briz, C. G.，等，在体电穿孔技术用于研究神经元亚群及单细胞连接的兴奋性。 J. Vis. Exp. (2017)

该视频演示了一种利用全细胞膜片钳电流钳技术研究表达荧光蛋白的神经元细胞兴奋性的方法。在电流钳模式下，可记录到反映神经元兴奋性的动作电位。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 电生理学

注意：本实验方案的目标是从经GFP电穿孔的小鼠脑中通过GFP表达在视觉上鉴定出的II/III层锥体神经元获取全细胞电流钳记录（或任何先前已电穿孔的其他荧光蛋白）。利用本方案，可研究通过子宫内电穿孔（IUE）引入的基因修饰对神经元电学特性的影响。特定放电模式的获得是一个渐进的分化过程，涉及多种离子通道的动态表达，并在出生后晚期阶段之前表现出短暂的放电模式。例如，在出生后16天（P16）之前，小鼠体感皮层II/III层中尚未观察到成熟的电生理反应。

1. 急性脑片制备的先决条件
   1. 使用高纯度水（双蒸水）配制1 L ACSF，其中包含119 mM NaCl、26 mM NaHCO₃、11 mM葡萄糖、2.5 mM KCl、1.2 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂和1 mM NaH₂PO₄。用HCl或NaOH将pH值滴定至7.3–7.4。将渗透压调节至290 mOsm。
   2. 使用特氟龙管（约1 mm）向ACSF中通入碳合气（95% O₂/5% CO₂）15–20分钟，以使pH值稳定在7.3–7.4。
2. 全细胞记录的先决条件
   1. 确保电生理实验台配备有记录室、灌流系统、显微镜、电极（记录电极、刺激电极和接地电极）、宏/微操纵器、坚固的防震台面和法拉第笼、刺激器、放大器和模数（A/D）转换器、装有采集软件的计算机，以及用于分析基因修饰神经元的GFP（或其他荧光染料）滤光片（图1A）。
   2. 配制细胞内液，包含115 mM谷氨酸钾、2 mM MgCl₂、10 mM HEPES、20 mM KCl、4 mM Na₂ATP和0.3 mM Na₃GTP，用KOH调节pH至7.2，并用KCl调节渗透压至290 mOsm。
   3. 通过拉制硼硅酸盐玻璃毛细管制作膜片钳电极。使用微电极拉制仪制备膜片钳电极。使用外径1.5 mm、内径0.86 mm、长度10 cm的硼硅酸盐毛细管。当电极内充满细胞内液时，其电阻应为3–10 MΩ。
   4. 以2 mL/min的流速向记录室持续灌注ACSF。将记录室温度维持在约33 °C。
3. 全细胞记录
   1. 使用移液管（剪去长尖端）或小刷子将脑片转移至记录室中，并用网格固定器压住脑片。以2 mL/min的流速持续向脑片灌注ACSF。
   2. 对GFP阳性神经元进行膜片钳记录。
      1. 将脑片放入记录室，先在低倍镜（10X）下通过显微镜找到目标区域，然后使用60倍物镜寻找待钳制的GFP阳性细胞。
      2. 用细胞内液填充记录电极。使用连接滤器（4 mm滤器）和微加载吸头的注射器将细胞内液注入记录电极。
      3. 将玻璃电极插入电极夹持器中，将电极尖端置于浴液中并聚焦于尖端。一旦电极进入浴液，即通过后压控制系统施加正压。
      4. 对荧光神经元进行膜片钳记录（图1B）。
         1. 在显微视觉引导下，保持电极内正压，接近目标细胞。当细胞表面出现微小凹陷时，释放正压。此时可能形成高阻封接（电阻大于1 GΩ）；若未形成，可施加轻微负压（抽吸）以促进封接。
         2. 在封接形成过程中，将电压钳保持电位设为-60 mV。一旦形成GΩ级封接，施加短暂抽吸脉冲以破裂电极尖端下的细胞膜，进入全细胞记录模式。
      5. 在电流钳模式下记录神经元活动。进入全细胞模式后，切换至电流钳模式并开始记录。例如，为记录细胞兴奋性，可施加持续500 ms的去极化电流刺激（100–400 pA）。
         1. 通过绘制随输入电流递增的动作电位数量来计算放电频率。
            注意：静息膜电位、输入电阻和膜电容也可从记录数据中计算得出。

结果

图1. 电生理设置及放电反应示例。A. 照片显示了在急性脑片上进行膜片钳实验所用的电生理装置。该装置置于法拉第笼内以消除噪声，设备放置在防震台上。左侧可见用于电极的电动显微操作器控制器。B. 在明场和绿色荧光条件下观察到的经GFP电穿孔的小鼠锥体神经元。可见记录电极附着于一个GFP阳性细胞。比例尺 = 10 µm。C. 经CAG-GFP电穿孔的对照层II-III神经元的放电模式，显示典型的规则性放电反应。动作电位的分布沿输入电流持续时间（X轴）大致呈规则分布。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硼硅酸盐玻璃毛细管（100 mm，外径/内径 1.0/0.58）	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
校准微量毛细移液管用吸管管组件	Sigma -Aldrich	A5177-5EA
蔗糖	Sigma -Aldrich	S0389
荧光成像显微镜 - MZ10F	Leica
Axiovert 200 显微镜	Zeiss
P-97 微电极拉制仪	Sutter Instrument Company	P-97
膜片钳分析软件（p-Clamp Clampfit 10.3）	Molecular Devices	-
数据采集软件（MultiClamp 700B 放大器）	Molecular Devices	DD1440A
电动显微操作器 + 旋转底座	Sutter Instrument	MP-225
气浮隔振台	Newport	-
微型蠕动泵	WPI