使用微电极阵列测量麻醉下新生仔猪脑内谷氨酸水平

摘要

来源：Geyer, E. D.，等。微电极阵列技术在完整仔猪脑麻醉诱导神经毒性研究中的应用。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了使用微电极阵列（MEA）测量麻醉新生仔猪脑内谷氨酸水平的方法。该操作包括在仔猪颅骨上制作颅窗，并将MEA插入目标脑区。MEA上涂覆有谷氨酸氧化酶的记录位点可将细胞外脑内谷氨酸转化为过氧化氢，从而产生可测量的电流。通过测量该电流并相对于背景噪声进行归一化处理，以确定麻醉状态下脑内的谷氨酸水平。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 仔猪及仔猪操作

1. 按照ARRIVE指南，系统性且随机地使用雄性和雌性仔猪，以消除任何潜在的性别相关混杂因素。
   注意：由于仔猪大脑生长的高峰期在出生后的3至5天内，因此实验仅使用3至5日龄的仔猪。
2. 确保仔猪在实验开始前至少24小时到达动物房，以适应环境。
   注意： 经过专业培训的兽医人员提供常规动物护理。仔猪饲养在独立控温且持续监测的笼具中，并饲喂营养全面的代乳品。 随意摄取 以防止低血糖。仔猪也不提供代乳（禁食），在麻醉前至少 3 小时提供，并供应毯子和玩具以确保正常的刺激水平。如果可能，将多只猪仔饲养在同一个笼子中以促进社交。

2. 用于仔猪模型中麻醉诱导神经毒性（AIN）研究的微电极阵列（MEAs）的开发与定制

注意：该技术使用基于酶的微电极阵列（MEA），其表面预先包被了酶，并电镀了间苯二胺二盐酸盐（mPD）。电极采用定制设计，具有40 mm的刚性轴，专为在仔猪中使用而制造（图1）。

1. 请参见MEA制备与校准的详细说明（图2）。

3. 猪仔的麻醉及定制立体定位仪的使用

1. 使用配备合适呼吸机和监测设备的麻醉工作站对动物进行麻醉，并在整个实验过程中持续监测脉搏血氧饱和度、无创血压、心电图和体温等生理参数，具体方法如前所述。对仔猪进行气管插管并实施机械通气，以1倍最小肺泡浓度（MAC）的七氟烷（约2.5%–3%）维持麻醉3.5小时。实验过程中须确保有经过培训的实验室人员在场。在皮肤准备前，使用电动剪毛器去除手术区域的被毛。
   注意： 所使用的麻醉剂浓度和作用时间可使实验模拟外科手术过程中实际麻醉暴露的时长。此外，七氟烷是儿科人群中应用最广泛的全身麻醉药，因此围绕其安全性的研究显得尤为重要。
2. 在将动物置入立体定位仪之前，开始给予罗库溴铵负荷剂量 2.5 mg/kg，并以 1.5 mg/kg/h 的速率持续输注，以防止动物在固定于定位仪中时发生移动。
   1. 在通过夹趾反应确认麻醉深度足够后，将仔猪置于专用于仔猪的立体定位仪中。
   2. 在立体定位架内提供足够的缓冲，将仔猪置于强制空气加热垫上，并添加额外的缓冲垫（例如，流化定位器）以防止压疮。
   3. 将上颌的齿部置于齿条上方（图3).
      注意： 齿条应处于足够高的位置，以牢固固定头骨。
   4. 将穿刺耳杆固定并旋紧于耳内，注意确保仔猪处于正中位置。将侧向固定装置的尖端置于耳道内，并稳固插入耳杆，直至听到提示鼓膜被穿透的“啪”声。将耳杆牢固地连接至颅骨，并确保两侧插入深度一致，以防止实验过程中颅骨发生移动（图4，A面板).
      注意： 保持仔猪体温（约 37.8–38.6 °C）至关重要，并需在整个操作过程中持续监测体温，以维持正常体温。这可以通过以下方式实现 通过 一条毯子和/或一盏加热灯。务必将加热灯放置在适当距离，以避免灼伤动物皮肤。
3. 沿颅骨中线做一个4-6厘米的切口，操作时需小心避免手术刀划伤颅骨。切开后，轻柔牵拉并采用钝性分离法将头皮从颅骨上剥离。用纱布轻轻擦拭颅骨，以去除任何结缔组织，暴露缝线。图4，B面板).
   注意： 非存活实验过程中无需保持无菌状态，但在存活实验过程中必须维持无菌条件。
4. 必要时进一步牵开头皮，以暴露目标区域并确定开颅的位置图5，图版A）。使用外科钻头制作一个直径约0.25 cm的颅骨开窗² （大小可根据实验目的调整）覆盖目标结构，注意避免损伤硬脑膜或其下方的脑组织（图5，B面板）。使用精细的外科剪刀切除覆盖在脑组织上的硬脑膜（图5，面板C).
5. 尽可能将电极垂直置于前囟上方，方法是将头戴装置的金属臂固定到仔猪立体定位仪的微操纵器上。在不接触颅骨表面的前提下，尽可能降低电极位置。记录前囟的坐标图6，A面板).
   1. 根据前囟确定目标结构的前后、内外以及深度坐标。使用适合物种和年龄的立体定位图谱确定立体定位坐标。本实验中，使用专为仔猪开发的立体定位图谱。
   2. 重新定位电极，使其处于正确的前后和内外侧位置，确保微电极和装置均垂直于表面。将伪参考电极置于头皮下方，确保与动物接触图6，面板B).
   3. 缓慢而轻柔地使用立体定位臂将电极降至脑内适当深度。在最后2 mm阶段，使用液压微推进器将电极进一步推进至精确位置。图6，C面板).
      注意： 电极位置应覆盖颅骨开窗区域。电极植入深度需根据目标脑区结构而调整。在非存活实验中，数据采集完成后无需缝合切口。

4. 七氟烷麻醉下细胞外谷氨酸的测定

1. 确保在整个操作过程中持续对仔猪进行生理监测。仔猪通过面罩吸入麻醉，为操作做好准备。
2. 植入MEA后，等待30分钟，使电极达到基线状态，以确保后续3小时内的测量结果准确（图7）。
3. 术后在手术部位皮下注射0.25%布比卡因（1 mL/kg），用于术后镇痛。此外，根据需要每72小时皮下给予一次缓释型丁丙诺啡。

结果

图1：SG-2微电极阵列类型的视觉对比。 SG-2阵列包含两个谷氨酸敏感位点和两个谷氨酸不敏感的哨点位点（每个位点150 µm × 20 µm）。（A） 左侧显示的是柔性轴微电极阵列。刚性轴微电极阵列为仔猪使用而定制设计，可在大型动物中实现更深的植入。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Advance Liqui-Wean 猪用代乳粉	PBS 动物健康
仔猪麻醉面罩锥形接口	VetEquip
Integra SL 麻醉工作站	DRE 兽医学		选择此麻醉工作站是为了最大程度地模拟儿科患者在手术室中所经历的临床监护环境。只要麻醉机能够提供充分的生理监测和干预能力，任何型号的麻醉机均可使用。
七氟烷	Ultane	0074-4456-04
溴化罗库溴铵注射液	Hospira	0409-9558-05
Medfusion 4000 静脉输液泵	Smiths Medical
Model 1530 重型研究型立体定位仪	Kopf		定制制作
Model 1541 猪仔适配器	Kopf		定制制作
红外照射灯	亚马逊	B000HHQ94C
Bair Hugger 躯干毯	3M	540
Bair Hugger	3M	750
无菌酒精消毒垫	Fisherbrand	22-363-750
碳钢肋背手术刀 刀片	Bard-Parker	#10
手术刀柄	哈维尔的	HAN-G4
手术剪	World Precision Instruments	504615
蚊式止血钳	斯克拉外科器械	17-1225
纱布垫	Fisherbrand	22-246-069
Adson 组织镊	Teleflex	181223
Dremel 111 雕刻刀头	亚马逊	Dremel 111
微电极阵列	肯塔基大学微电子技术中心		S2 4Ch MEA；定制
前置放大器	Quanteon		2pA/mV
银丝，PFA，0.008" .0110，裸露" 包被的	A-M Systems	786500
精细显微操作器	Narishige科学仪器实验室	MO-8