准备大鼠模型以使用电生理学设置评估视觉通路完整性

摘要

来源:Nguyen， C. T. et al.， 麻醉大鼠视网膜电图和视觉诱发电位的同时记录。J. Vis. Exp. （2016 年）

该视频演示了大鼠模型的制备，以研究视网膜健康和视觉通路完整性。将视觉诱发电位和视网膜电图参考电极和有源电极连接到大鼠，然后将平台与 Ganzfeld 碗前面的大鼠对齐，以获得均匀的视网膜照明，并关闭法拉第笼以避免外部干扰。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 慢性视觉诱发电位 （VEP） 电极的植入前

注意:如果要同时收集视网膜电图 （ERG） 和 VEP 信号，则必须在信号收集前至少 1 周通过手术植入动物 VEP 电极。

1. 实验前用洗必泰（0.5% 在 70% 乙醇中）清洁，对手术台进行消毒。使用前对所有手术设备进行高压灭菌。用消毒的手术单盖住动物。确保所有实验者都佩戴外科口罩、防护服和消毒手套。
2. 用 3 - 3.5% 异氟醚和 O₂ 以 3 L/min 的流速诱导麻醉。在整个手术过程中保持 1.5% 和 2 L/min 的麻醉。在没有爪捏反射的情况下确保足够的麻醉深度。
3. 将 1% 羧甲基纤维素钠涂抹在角膜上，以防止眼睛干燥。
4. 在前额上方、眼睛后方和耳朵前方剃掉 30 毫米 x 30 毫米的区域。
5. 将动物放在加热垫 （37°C） 上，以保持体温并用立体定位框架稳定动物的头部。
6. 用 10% 聚维酮碘消毒剃须区域 3 次。对于眼睛附近的区域，避免使用含酒精的消毒剂，这符合外科技术专家协会制定的实践标准。
7. 用手术刀在头部做一个正中矢状切口，然后从该切除中切出一个直径为 ~ 20 毫米的真皮组织圆圈，以露出颅骨。
8. 通过刮擦并用纱布擦干来去除下面的骨膜，以露出冠状和矢状颅缝合线。
9. 使用连接到钻头的牙科毛刺，在立体定位坐标处穿过两个半球的颅骨两个孔（直径 0.7 毫米，深度 ~ 1 毫米）:尾部到前囟 7 毫米，外侧到中线 3 毫米。
10. 将不锈钢螺钉（直径 0.7 mm，长度 3 mm，用洗必泰消毒）拧入两个预制孔中，深度可达 ~ 1 mm（螺钉暴露 2 mm），以实现牢固锚固。它接触硬脑膜而不会损坏下面的皮质组织。
11. 通过用纱布擦干颅骨，并在 ~ 4 点钟和 8 点钟位置用两条 3 - 0 缝合线缩回松弛的皮肤，为牙科汞合金准备手术区域。
12. 将牙科汞合金涂抹在暴露的颅骨上，以将螺钉电极（步骤 1.10 中描述的不锈钢螺钉）固定到位。确保 ~ 1.5 毫米的螺钉保持裸露以进行记录。
13. 拆下回缩缝合线。
皮
14. 下注射 0.5% 卡洛芬 （5 mg/kg） 用于镇痛，皮下注射生理盐水（氯化钠 0.9%，1.5 ml）用于补液。
15. 让动物在单独的笼子里恢复。在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让动物无人看管。
16. 在动物从手术中完全恢复之前（至少 5 天），请勿将动物送回其他动物的陪伴处。
17. 继续皮下注射 0.5% 卡洛芬镇痛 （5 mg/kg），每天一次，持续 4 天。
18. 记录手术后 1 周的 ERG 和 VEP。

2. ERG 和 VEP 记录

1. 数据收集准备
   1. 使用计算机软件根据下面推荐的设置同时触发刺激并采集数据。
      1. 放大信号（ERG:×1,000，VEP:x10,000），增益由隔离的前置放大器和放大器内部设置，并且双眼阻抗匹配。
      2. 在 4 毫秒的记录窗口（650 毫秒记录窗口）上将 ERG 的采样率设置为 2,560 kHz，为此，请单击数据采集软件中的"时基"选项卡（有关软件的名称和版本，请参阅材料表），选择"2,560"作为样本，选择"500 ms"作为时间，这将返回 650 毫秒的记录窗口。
         1. 使用相同的方法在 250 毫秒 epoch 上将 VEP 的采样率设置为 10 kHz。允许 ERG 和 VEP 记录的刺激前基线为 10 毫秒。为此，请单击"设置"选项卡;选择 "Stimulator" 以调出一个新的对话窗口;在该窗口中，从 "Mode" 的下拉列表中选择 "pulse";并将 "delay" 的值设置为 "10 ms"。
      3. 将 ERG 带通滤波设置为 0.3 - 1,000 Hz （- 3 dB）。这是通过单击数据采集软件中的"生物放大器"来完成的。然后将 "High Pass" 的值设置为 "0.3Hz"，将 "low pass" 的值设置为 "1 kHz"。
      4. 使用 2.1.1.3 中的上述方法，按照国际临床视觉电生理学会 （ISCEV） 对人类 VEP 记录的建议，将 VEP 带通设置为 0.1 - 100 Hz （- 3 dB）。

2. 电极制备

1. 通过将银线或鳄鱼夹分别连接到电极引线上，定制 ERG 有源/非有源和 VEP 有源/非活性电极。商业获得接地电极。
2. 对于 4 个定制电极，从电极引线延长线上剪下公端。用手术刀刀片去除 1 cm 的外部聚四氟乙烯绝缘涂层，确保内线不损坏。
3. 通过切割 70 mm 长的银线（0.3 mm 厚）并形成直径为 ~ 8 mm 的环来环绕大鼠眼睛，对 ERG 非活性电极进行预成型。通过在 1 ml 移液器吸头上塑造环来准备一个均匀的圆圈。
4. 通过切割 70 mm 长的银并形成一个纵向直径为 ~ 8 mm 的椭圆以钩住大鼠门牙，来预塑造 VEP 非活性电极。
5. 通过切割 30 毫米长的银线并形成一个小环以轻轻接触大鼠角膜（直径 ~ 1-2 毫米），对 ERG 有源电极进行预成型
6. 通过将银与裸露的内线缠绕在一起，将电极（2 个 ERG 有源、2 个 ERG 无源、1 个 VEP 无源）牢固地连接到电极引线上。
7. 用遮蔽胶带对多余的裸露金属进行绝缘，以减少光伏伪影。
8. 在 ERG 上，非活性电极将一小块粘扣带（~ 5 mm × 20 mm）粘在遮蔽胶带上，以便稳定地连接到啮齿动物颈带上。
9. 将鳄鱼夹连接到电极引线的内线，制成 VEP 有源电极。
10. 在记录之前，使用 9 V DC 电源用氯化物电镀银线的裸露表面（即非活性环和活性尖端）20 秒，以改善信号传导。
    1. 为此，将 ERG 电极丝的银尖（充当原电池的阳极）浸入生理盐水中;并将该电极丝的另一端连接到 9 V 电池的正极端子。
    2. 将另一根电线（阴极）连接到电池的负极端子，并将另一端也浸入盐水中。20 秒后断开连接，观察 ERG 电极丝的银色尖端均匀涂上白色。
       注意:为每次实验准备新的 ERG 电极（~ 最多 8 小时），以确保氯化物涂层的通畅性。

3. 动物准备

在
1. 光线密闭的房间中记录之前，将动物暗适应过夜（≥ 8 小时）。通过关闭室内灯、关闭所有门和百叶窗，确保最大限度地适应黑暗。通过在门/窗的交界处放置防光材料并将计算机屏幕放在厚厚的黑色窗帘外，最大限度地减少漏光。
2. 在暗室中借助暗红发光二极管 （LED;17.4 cd.m-2，λ_max = 600 nm） 进行动物制备，以维持杆敏感度。
3. 通过肌肉注射氯胺酮/甲苯噻嗪 （60: 5 mg/kg） 麻醉大鼠。通过没有爪捏反射来确认足够的麻醉深度。
4. 为了维持镇静，如有必要，在 50 分钟后给予另一剂麻醉剂（初始剂量的 50%）。
5. 对于额外的局部麻醉，将一滴 0.5% proxymetacaine 滴在每只眼睛上，并眨眼去除多余的液体。
6. 对于散瞳，在每只眼睛上滴一滴 0.5% 托吡卡胺，然后擦干多余的液体。

4. ERG 和 VEP 电极定位

1. 将动物放在位于法拉第笼中的 Ganzfeld 碗前面的 ERG 平台上。避免使用电加热垫，因为它会将电噪声引入电生理记录中。
   注意: 该平台连接到循环加热水平台以维持体温。
2. 用一条钩环紧固件将动物固定在平台上，但不要紧紧地放在颈背上。
3. 将非活性的 VEP 电极钩在麻醉大鼠的下门牙周围。
4. 通过将巩膜环无创地环绕眼睛赤道来定位 ERG 非活性电极。通过将电极连接到颈背周围的钩环紧固件条来稳定这一点。对侧眼重复此作。
5. 通过将鳄鱼夹连接到预先植入颅骨上的不锈钢螺钉上，固定 VEP 有源电极。
6. 在放置 ERG 活性电极之前，将 1% 羧甲基纤维素钠的一小滴滴放在角膜上，以提高信号质量。
   注意:粘胶液还有助于在整个实验过程中保持角膜水合作用，以最大限度地减少啮齿动物干燥型白内障的形成。
7. 在下切牙上滴一小滴 1% 羧甲基纤维素钠，以改善 VEP 非活性电极的接触，从而改善信号质量。
8. 使用连接到定制立体定位臂的显微作器，将 ERG 有源电极定位为轻轻接触中央角膜表面。
将
9. 2 - 5 mm 的接地针电极（不锈钢）皮下插入尾部。
10. 如有必要，请在录制前擦干下眼睑中多余的液体，以提高信号质量。
11. 将平台滑得更靠近 Ganzfeld 碗，确保动物的眼睛与碗的开口对齐，以实现两个视网膜的均匀照明（参见步骤 2.4.1）。
12. 关闭法拉第笼以减少外来噪音。

材料