使用电生理装置制备大鼠模型以评估视觉通路完整性

摘要

来源：Nguyen, C. T. 等，在麻醉大鼠中同步记录视网膜电图和视觉诱发电位 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了制备大鼠模型以研究视网膜健康和视觉通路完整性的方法。将视觉诱发电位和视网膜电图的参考电极与活动电极连接至大鼠，随后调整平台使大鼠位于全视野刺激碗前方，以实现视网膜均匀照明，并关闭法拉第笼以避免外界干扰。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 植入前慢性视觉诱发电位（VEP）电极

注意：若需同时采集视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）信号，则动物必须在信号采集前至少1周通过手术植入VEP电极。

1. 实验前使用氯己定（0.5% 溶于 70% 乙醇）清洁手术台面进行消毒。所有手术器械在使用前均需高压灭菌。用无菌手术巾覆盖动物。确保所有操作人员佩戴外科口罩、手术服和无菌手套。
2. 以 3 - 3.5% 异氟烷与 O₂ 混合，氧流量为 3 L/min，诱导麻醉。术中维持麻醉浓度为 1.5%，氧流量为 2 L/min。通过检测后肢夹捏反射是否消失来确认麻醉深度足够。
3. 在角膜上涂抹 1% 羧甲基纤维素钠，防止眼睛干燥。
4. 剃除眼睛后方、耳前方约 30 mm × 30 mm 区域的毛发。
5. 将动物置于 37˚C 加热垫上以维持体温，并使用立体定位仪固定头部。
6. 用 10% 聚维酮碘对剃毛区域进行三次消毒。靠近眼部区域时，避免使用含酒精的消毒剂，应遵循手术技术人员协会（Association of Surgical Technologists）制定的操作规范。
7. 使用手术刀在头部正中矢状方向做一纵行切口，并切除直径约 20 mm 的皮肤组织，暴露颅骨。
8. 刮除并用纱布擦干骨膜，以暴露冠状缝和矢状缝。
9. 使用连接在钻机上的牙科钻头，在立体定位坐标（前囟后方 7 mm，中线外侧 3 mm）处于两侧半球颅骨上钻两个孔（直径 0.7 mm，深度约 1 mm）。
10. 将不锈钢螺钉（直径 0.7 mm，长度 3 mm，经氯己定灭菌）旋入预先钻好的两个孔中，深度约 1 mm（螺钉外露 2 mm），以实现牢固固定。此深度可接触硬脑膜，但不损伤下方皮层组织。
11. 用纱布擦干颅骨表面，为牙科填充剂操作准备手术区域，并在约 4 点和 8 点钟位置使用两根 3-0 缝线牵拉并固定松动的皮肤。
12. 将牙科填充剂涂抹于暴露的颅骨表面，以固定螺钉电极（即步骤 1.10 中所述的不锈钢螺钉），确保螺钉约 1.5 mm 部分外露，以便记录信号。
13. 移除牵拉用缝线。
14. 皮下注射 0.5% 卡洛芬（5 mg/kg）用于镇痛，同时皮下注射生理盐水（0.9% 氯化钠溶液，1.5 ml）以补充体液。
15. 将动物置于单独笼中恢复。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
16. 在动物完全从手术中恢复前（至少 5 天），不得将其放回与其他动物共同饲养的环境中。
17. 继续每日皮下注射 0.5% 卡洛芬（5 mg/kg）进行镇痛，持续 4 天。
18. 术后 1 周开始记录视网膜电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）。

2. 视网膜电图和视觉诱发电位记录 

1. 数据采集准备​
   1. 使用计算机软件根据下述推荐设置同步触发刺激并采集数据。
      1. 扩增信号 （ERG：×1,000，VEP：×10,000），增益由独立的前置放大器和放大器内部设定，并确保双眼阻抗匹配。
      2. 将ERG的采样率设置为在650毫秒记录窗口内4 kHz（2,560个采样点）。为此，请在数据采集软件中点击“时间基准”选项卡（软件名称和版本见材料表），选择“2,560”作为采样点数，“500 ms”作为时间，系统将生成650毫秒的记录窗口。
         1. 使用相同方法将VEP的采样率设置为每250毫秒时段10 kHz。ERG和VEP记录均设置10毫秒的刺激前基线。操作方法为：点击“Setup”选项卡，选择“Stimulator”以打开新的对话窗口；在该窗口中，从“Mode”的下拉列表中选择“pulse”，并将“delay”的值设置为“10 ms”。
      3. 将ERG带通滤波设置为0.3 - 1,000 Hz（-3 dB）。在数据采集软件中，点击“Bio Amplifier”，然后将“High Pass”值设为“0.3 Hz”，将“Low Pass”值设为“1 kHz”。
      4. 使用2.1.1.3节中上述方法，将视觉诱发电位（VEP）带通滤波设置为0.1 - 100 Hz（-3 dB），该参数设置符合国际临床视觉电生理学会（ISCEV）对人类VEP记录的推荐标准。

2. 电极制备

1. 通过将银丝或鳄鱼夹分别连接到电极导线上，定制制作ERG活动/非活动电极和VEP活动/非活动电极。 commercially obtain ground electrode.
2. 对于4个自制电极，剪下电极延长线的公端。用手术刀片去除外层聚四氟乙烯绝缘涂层约1 cm，注意不要损伤内部导线。
3. 预先制作ERG非活动电极：截取一段70 mm长的银丝（直径0.3 mm），弯成直径约8 mm的环形，以环绕大鼠眼睛。可通过在1 ml移液器吸头上来塑形，确保形成均匀的圆环。
4. 预先制作VEP非活动电极：截取一段70 mm长的银丝，弯成纵向直径约8 mm的椭圆形，以便钩住大鼠门齿。
5. 预先制作ERG活动电极：截取一段30 mm长的银丝，弯成小环，用于轻柔接触大鼠角膜（直径约1–2 mm）。
6. 通过将银丝与暴露的内芯导线绞合，将电极（2个ERG活动电极、2个ERG非活动电极、1个VEP非活动电极）牢固地连接至电极导线。
7. 用美纹纸胶带包裹多余的裸露金属部分，以减少光伏伪影。
8. 在ERG非活动电极的美纹纸胶带上粘贴一小块钩毛搭扣（约5 mm × 20 mm），以便稳定固定在啮齿类动物颈带之上。
9. 将鳄鱼夹连接至电极导线的内芯导线，制成VEP活动电极。
10. 记录前，使用9 V直流电源对银丝的裸露表面（i.e., 非活动环和活动尖端）进行20秒的氯化电镀处理，以改善信号传导。
    1. 具体操作：将ERG电极银丝的尖端（作为原电池的阳极）浸入生理盐水中，并将该电极导线的另一端连接至9 V电池的正极。
    2. 将另一根导线（阴极）连接至电池负极，并将其末端也浸入生理盐水中。20秒后断开连接，观察ERG电极银丝尖端应均匀覆盖白色涂层。
       NOTE: 每次实验会话（约持续8小时）前均需制备新的ERG电极，以确保氯化涂层的完整性。

3. 动物准备

1. 在记录前一晚（≥ 8 小时）将动物置于完全避光的房间内进行暗适应。为确保最大程度的暗适应，需关闭室内灯光并关紧所有门窗。通过在门窗接缝处放置遮光材料，并将计算机屏幕置于厚实的黑色窗帘之外，以尽量减少光线泄漏。
2. 在暗室中进行动物准备操作，借助微弱的红色发光二极管（LED；17.4 cd.m^-2, λ_max = 600 nm）照明，以维持视杆细胞的敏感性。
3. 通过肌肉注射氯胺酮/赛拉嗪（60:5 mg/kg）对大鼠进行麻醉，并通过检查其足部夹捏反射是否消失来确认麻醉深度是否足够。
4. 为维持镇静状态，必要时可在50分钟后追加一次麻醉剂量（为初始剂量的50%）。
5. 为实施局部表面麻醉，向每只眼睛滴加一滴0.5%丙美卡因，并轻眨眼睛以去除多余液体。
6. 为实现瞳孔扩张，向每只眼睛滴加一滴0.5%托吡卡胺，然后擦干多余液体。

4. 视网膜电图和视觉诱发电位电极的放置

1. 将动物放置在法拉第笼内的全视野碗前方的ERG平台上。避免使用电加热垫，因为它可能在电生理记录中引入电噪声。
   注意：该平台连接至循环加热水系统，以维持动物体温。
2. 使用一条钩环固定带，牢固但不过紧地缠绕在动物颈背部，将其固定在平台上。
3. 将视觉诱发电位（VEP）的无效电极钩在麻醉大鼠的下门齿上。
4. 通过无创方式将ERG无效电极环绕于眼球赤道部的巩膜环周围。通过将电极固定在环绕颈背部的钩环固定带上加以稳定。对对侧眼重复此操作。
5. 通过鳄鱼夹将VEP有效电极连接至预先植入颅骨的不锈钢螺钉上，完成固定。
6. 在放置ERG有效电极前，于角膜表面滴加一小滴1%羧甲基纤维素钠，以提高信号质量。
   注意：这种黏性液体还有助于在整个实验过程中维持角膜的水合状态，从而减少啮齿类动物出现干燥型白内障的风险。
7. 在下门齿处滴加一小滴1%羧甲基纤维素钠，以改善VEP无效电极的接触效果，进而提升信号质量。
8. 使用连接在定制立体定位臂上的微操作器，将ERG有效电极调整至轻触中央角膜表面的位置。
9. 将接地针电极（不锈钢）插入尾部皮下2–5 mm。
10. 如有必要，在记录前擦干下眼睑多余的液体，以提高信号质量。
11. 将平台向全视野碗方向滑动，确保动物双眼与碗的开口对齐，以实现双侧视网膜均匀照明（参见步骤2.4.1）。
12. 关闭法拉第笼，以减少外界噪声干扰。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鳄鱼夹	Generic brand	HM3022	用于连接VEP螺钉电极与电缆的不锈钢26 mm夹子
生物放大器	ADInstruments	ML 135	用于放大ERG和VEP信号
1.0%羧甲基纤维素钠	Allergan	CAS 0009000-11-7	粘稠液体，用于提高主动ERG电极的信号质量
卡洛芬 0.5%	Pfizer Animal Health Group	CAS 53716-49-7	商品名：Rimadyl注射液（50 mg/mL）。用于术后镇痛，用生理盐水稀释至0.5%（5 mg/mL）
氯己定 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	用于手术器械的消毒
循环水浴	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	用于在手术及电生理记录期间维持麻醉动物的体温
牙科银汞合金	DeguDent GmbH	64020024	用于包裹电极-颅骨组件，以增强其坚固性
牙科钻头	Storz Instruments, Bausch and Lomb	#E0824A	直径约0.7 mm的微型钻头，用于在每侧大脑半球颅骨上钻孔以植入VEP螺钉
钻机	Bosch	Dremel 300系列	用于颅骨钻孔的自动钻机
电极导线	Grass Telefactor	F-E2-30	用于连接银丝电极与放大器的铂金电缆
法拉第笼	定制		确保避光以维持暗适应状态。包围Ganzfeld装置以提高信噪比
纱布拭子	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	用于手术期间干燥手术切口和暴露的颅骨表面
Ganzfeld积分球	Photometric Solutions International		定制设计的光刺激器：直径36 mm，孔径13 cm
魔术贴	VELCRO Australia Pty Ltd	VELCRO Brand Reusable Wrap	钩环式固定带，用于固定电极和记录平台上的动物
异氟烷 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	商品名：Isoflo(TM) 吸入麻醉剂。与氧气混合的药用级吸入麻醉剂，用于VEP电极植入手术
氯胺酮	Troy Laboratories	Ilium Ketamil	商品名：Ketamil注射液，品牌：Ilium。用于电生理记录的药用级麻醉剂
Luxeon LED灯	Phillips Lighting Co.		用于光刺激，包含二十个5瓦和一个1瓦LED灯
显微操作器	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	在记录期间固定ERG主动电极
针状电极	Grass Telefactor	F-E2-30	皮下插入尾部，作为ERG和VEP的接地电极
去氧肾上腺素 2.5% 滴眼液	Bausch and Lomb	CAS 61-76-7	与托吡卡胺联合滴注，以实现ERG记录时的最大瞳孔扩张
聚维酮碘 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	商品名：Betadine，10% 500 mL 抗菌剂，用于术前剃毛皮肤的消毒准备
Powerlab数据采集系统	ADInstruments	ML 785	控制LED
丙美卡因 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	用于ERG记录期间的角膜麻醉
生理盐水溶液	Gelflex		非注射用，用于银丝电极的电镀
Scope软件	ADInstruments	版本 3.7.6	通过Powerlab系统同步触发刺激并采集数据
银（细圆丝）	A&E metal	0.3 mm	用于制作主动和非主动ERG电极，以及非主动VEP电极
不锈钢螺钉	MicroFasterners		直径0.7 mm，长3 mm，植入初级视皮层上方，作为主动VEP电极
立体定位仪	David Kopf	Model 900	小型动物立体定位装置，根据Paxinos & Watson 2007年大鼠脑图谱坐标定位初级视皮层
手术刀片	Swann-Morton Ltd.	206	用于切开覆盖初级视皮层区域的皮肤，以植入VEP电极
缝合线	上海浦东金环医疗用品有限公司		3-0编织丝线，不可吸收，用于VEP电极植入手术期间的皮肤牵拉
妥布霉素眼膏 0.3%	Alcon Laboratories	CAS 32986-56-4	商品名：Tobrex。术后涂抹于皮肤切口周围的预防性抗生素软膏
托吡卡胺 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 1508-75-4	商品名：0.5% Mydriacyl滴眼液，滴注以实现ERG记录所需的散瞳
赛拉嗪	Troy Laboratories	Ilium Xylazil-100	用于电生理记录的药用级麻醉剂
移液器吸头	Eppendorf Pty Ltd	0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL，用于自制电极
Lethabarb 安乐死注射液	Virbac (Australia) Pty Ltd	LETHA450	325 mg/mL 戊巴比妥钠，用于快速实施安乐死
Microsoft Office Excel	Microsoft	版本 2010	用于数据分析的电子表格软件