通过微机械刺激在神经元中诱导轴突串珠样膨大

摘要

来源：Servello, D.，等。用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了通过在神经元上施加微机械刺激来诱导轴突串珠样变的过程。该系统由连接至注射器的微移液管组成，注射器通过管路内含缓冲液。使用显微操作器将微移液管定位在神经元上方，随后施加流体压力，以诱导轴突形成串珠样结构。

方案

1. 设置喷射移液装置

注意：该装置包含五个基本组件：玻璃移液管、管路、注射器、显微操作器和缓冲液（Hank's）表1。任何具有生理相关盐浓度的缓冲液均可用于此装置中。

1. 使用显微拉针仪，按照指定参数拉制硼硅酸盐玻璃移液管，使其尖端开口直径约为45 µm 表 2.
   注意： 研究发现，在实验条件下，移液管开口直径为45 µm较为合适。开口尺寸的轻微变化通常不会显著影响实验结果。需要注意的是，若开口尺寸与此数值有较大偏差，仍可通过调节与移液管经管路相连的注射器高度来实现膨体诱导，但需重新校准压力值。
2. 将未拉制的一端插入细橡胶管中。
   注意： 输液管管壁应薄且刚性，以最大限度降低流体阻力，确保注射器高度与流经移液管的液体压力成正比，且阻力可忽略不计。输液管长度不应超过约0.6 m，以进一步降低阻力。
3. 将管路的另一端通过带可旋转阀门的连接器连接至10 mL塑料注射器。
   注意： 塑料注射器需保持在恒定且可测量的高度，以确保准确估算从移液管流出的假设压力。采用190 mm的高度，因为该高度提供的压力最小，但能可靠地诱导轴突形成曲张。如果压力导致细胞从盖玻片表面脱落，也可使用其他高度值。建议在整个实验过程中保持相同的设置。
4. 将移液管插入显微操作仪的螺口顶部，以固定移液管。旋紧显微操作臂上附带的金属平头螺丝，使其夹住移液管未拉制的一端，位置位于橡胶管连接处稍上方。将移液管倾斜至与含神经元的盖玻片表面呈45°角。注意：显微操作仪的结构应确保在夹持移液管时不会压迫橡胶管。显微操作仪必须能够控制移液管在x、y和z三个方向上的移动，以便精确地将其定位至细胞可及范围内。下文提供了该装置的示意图和照片（图1).
5. 打开荧光滤光片，打开光圈，确保可通过物镜观察到荧光斑点。使用显微操作器将移液管移动至使其尖端与荧光斑点对齐的位置，并将移液管下放至略高于细胞培养皿（35 mm × 10 mm）表面的位置。到位后，打开透射光，关闭荧光。
6. 使用镊子将一个盖玻片（细胞面朝上，朝向移液管）从细胞培养板转移至含有约 2 mL 于室温的 Hank's 缓冲液的细胞培养皿中。
7. 将含有盖玻片的培养皿放置于显微镜载物台上。
8. 使用细调焦旋钮和20倍物镜，将焦平面调至细胞上方约四整圈（约0.4 mm）的位置。利用显微操作仪调整移液管尖端，使其通过目镜观察时位于该焦平面中央偏左侧并清晰对焦。
   注意： 树突是应与其起源的细胞体位于同一视野中的突起。为诱导轴突串珠样结构，应追踪从细胞体延伸出的较长突起，直至中段和远端轴突。

2. 利用可拉伸膜系统校准移液器的压力

1. 使用与上述相同的参数设置喷射移液装置，作用于含有微加工硅胶膜的系统（直径 500 µm，厚度 50 µm），并将显微镜聚焦在膜表面。
   注意： 该系统设计用于测量微小压力值，其原理已有文献报道。若喷射实验采用完全相同的设置，则此测量仅需进行一次即可。
2. 将显微镜聚焦在微点阵列上（微点直径为 4 µm，中心间距为 10 µm）。打开截止阀，使液体从移液管中流出。利用共聚焦显微镜观察膜在流体压力作用下的形变情况。
3. 采用线性模型确定与膜形变相对应的压力值。
   注意： 尽管最近一项研究发现，当注射器高度为 190 mm 时，膜的形变量为 w = -3.143 ± 0.69 µm，但当前移液管设置下产生的压力为 0.25 ± 0.06 nN/µm²，处于生理和病理相关范围内。然而，注射器高度并非唯一决定因素，其他因素也会影响施加于神经元上的精确压力值，包括移液管开口大小、移液管尖端相对于细胞的位置（距离和角度）以及管路本身的柔韧性。

3. 喷射诱导产生曲张

1. 当移液管就位后，将显微镜聚焦于包含感兴趣区域的焦平面。将细胞及其突起置于成像视野（通过相机实时捕获所见）的左侧半部分，使其位于喷射区域之内，而右侧半部分则位于喷射区域之外。
   注意：由于神经元的轴突和树突具有广泛的向外生长特性，一个神经元的所有突起几乎不可能全部位于同一喷射区域内。这实际上是该系统的一个优势，可允许研究喷射的局部效应。有两种可用于诱导神经元串珠样变（varicosities）的喷射方式：长时间喷射和脉冲式喷射。
2. 喷射
   1. 长时间喷射
      1. 将注射器置于适当高度，即高于含培养神经元的盖玻片190 mm处。以优化的曝光时间开始对感兴趣区域进行延时成像，以清晰显示神经元形态。以2秒间隔至少采集15帧图像（共30秒），作为基线数据。可根据实验需求调整采集间隔。在第16帧时，打开注射器的可旋转截止阀，使液体持续流动75帧（150秒）。在第75帧时，关闭阀门以停止液体流动。停止视频采集。
         ​注意：对于培养7–9天（DIV）的神经元，通常在5–10秒内即可诱导出轴突串珠样变；而较老的神经元形成串珠样变所需时间更长。
   2. 脉冲式喷射（持续2秒）
      1. 将注射器置于适当高度（190 mm）。开始延时成像，以2秒间隔至少采集15帧图像（共30秒）。在第16帧时，打开注射器阀门使液体流动，2秒后关闭阀门。随后等待5–20秒（根据待测试频率而定），再次打开阀门。重复开闭阀门以产生液体脉冲，总持续时间为150–300秒。继续延时成像20分钟，以记录恢复阶段。
         注意：当脉冲间隔超过10秒时，诱导产生的串珠样变显著减少；在20秒间隔下，脉冲无法诱导出任何串珠样变。为获得可靠且一致的串珠样变形成效果，建议注射器高度保持在约190 mm。注射器高度和液体压力不得过高，以免导致细胞从盖玻片表面脱落。
3. 使用前一天，用约10 mL 70%乙醇冲洗整个装置（移液管、管路和注射器）进行清洁。乙醇冲洗后，再用10 mL Hank's缓冲液（或其他所需缓冲液）冲洗装置，以使系统为当天使用做好准备。当日实验结束后，按前述方法用乙醇清洗装置，防止污染物在过夜期间滋生。

表1：Hank's缓冲液配方。该配方用于制备在细胞膨大实验方案及活细胞成像过程中所使用的缓冲液。

Hank's 缓冲液（过滤，pH = 7.4，4 °C 保存）
150 mM	NaCl
4 mM	KCl
1.2 mM	MgCl2
1 mM	CaCl2
10 mg/mL	D-葡萄糖
20 mM	HEPES

表2：玻璃微电极拉制参数。提供在玻璃微电极拉制仪上设置的参数，以获得直径约为45 µm的开口。

玻璃微电极拉制参数
加热	拉力	速度	延迟	压力	斜坡
501	0	15	1	500	530

结果

图1： 喷射装置的示意图与照片。(A) 显示整体显微镜装置的照片。(B) 喷射装置，显示由显微操作器夹持并连接至橡胶管的玻璃移液管。(C) 相差图像，聚焦于原代海马神经元平面，右下角显示移液管的阴影。(D) 细胞外平面聚焦于喷射移液管尖端。(E) 诱导曲张体的距离示意图与计算压力。比例尺 = 50 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
橡胶管	Fisher Scientific	14-169-1A
10 cc 塑料注射器及推杆	Becton Dickinson
显微操作仪	Sutter Instruments
细胞培养皿（35 mm × 10 mm）	Corning	3294
Model P-1000 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments
Eclipse TE2000-U 显微镜	Nikon
Plan Fluor ELWD 20x 物镜	Nikon	62933	物镜
Apo TIRF 100x/1.49 油镜	Nikon	MRD01991	物镜
HEPES	Fisher Scientific	BP410-500
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-500
MgCl₂	Fisher Scientific	BP214-500
NaCl	Fisher Scientific	S640-3
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
CaCl₂	Fisher Scientific	C70-500