用于小鼠大脑中稳定单神经元记录的可注射网状电子设备

摘要

来源:Schuhmann Jr.、TG 等人<a href="https://app.jove.com/v/58003">用于稳定慢性啮齿动物电生理学的注射器注射网状电子设备。J. Vis. Exp. （2018 年）。

该视频演示了如何将网状电子探针注射到小鼠大脑中，以便在单神经元水平上进行稳定的长期记录。将颅骨外露的麻醉小鼠固定在立体定位框架上，并通过钻孔将探针的网状设备区域注入大脑。探头的输入-输出焊盘连接到电路，并使用数据采集系统获得记录。

方案

1. 将网状电子元件立体定向注射到活体小鼠大脑中

注:小鼠通过腹腔注射 75 mg/kg 氯胺酮和 1 mg/kg 右旋糖的混合物进行麻醉。手术开始前用脚趾捏法验证麻醉程度。通过在麻醉下将小鼠放在 37 °C 的恒温毯上来维持体温。手术实施了适当的无菌技术，包括但不限于在使用前将所有金属手术器械高压灭菌 1 小时，使用消毒手套，在整个手术过程中使用热珠消毒器，维持手术部位周围的无菌区域，用 70% 乙醇消毒塑料器械，并在切口前用碘伏准备脱毛的头皮皮肤。对于存活手术，手术结束后，在伤口周围涂抹抗生素软膏，并将小鼠放回配备有 37 °C 加热垫的笼子中。小鼠在恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前不会无人看管。小鼠通过腹膜内注射以每 12 h 0.05 mg/kg 体重的剂量给予丁丙诺啡镇痛，手术后长达 72 h。手术后将小鼠与其他动物分离。通过腹膜内注射剂量为 270 mg/kg 体重的戊巴比妥或通过经心灌注对小鼠实施安乐死。

1. 麻醉鼠标并将其固定在立体定位框架中。
2. 在小鼠的眼睛上涂抹眼部润滑剂，以防止在麻醉下干燥。
3. 使用牙钻和立体定位框架在颅骨上的所需坐标处打开开颅手术。在远离注射部位的地方打开第二个开颅手术，以插入不锈钢接地螺钉或电线。
4. 用牙科粘固剂将夹紧基材固定在颅骨上。在基材上切出大约 1 mm 宽的间隙，以提高手术后期折叠步骤的可靠性。
   注意:切割成"L"形的扁平柔性电缆 （FFC） 效果很好（图 4A），尽管许多材料只要具有适合 32 通道零插入力 （ZIF） 连接器（设计用于 0.18 ± 0.05 mm 厚电缆）的正确厚度就可以工作。
5. 使用直角端夹将带有包含网状电子元件的针头的移液器支架安装到立体定位框架上（图 2C 和图 3A）。
6. 使用大约 0.5-1 m 长的毛细管将移液器支架的侧出口连接到固定在注射泵中的 5 mL 注射器（图 3D）上。
   注意:在将毛细管连接到移液器支架之前，请确保毛细管中没有气泡。气泡会中断注射过程中的流动，并阻止网状电子元件的平稳、受控输送。
7. 使用立体定位框架将针尖定位在大脑中所需的起始位置。
   注意:此处使用的网状电子探针设计为记录电极，分布在约 2 mm 的长度上，第一个电极位于距离网状电子器件的起始边缘约 0.5 mm（图 1A 中最左侧的边缘）。因此，应选择立体定位坐标，使起始位置比感兴趣的大脑区域深 0.5 毫米。在掩模设计过程中，可以自由选择网状电子设备中记录电极的分布和位置，并且应选择记录电极，以便记录电极在沿其立体定位轨迹注射时跨越感兴趣的大脑区域。
8. 定位相机（图 3B）以显示玻璃针内网状电子探针的顶部。一些软件允许用户在屏幕上画一条线来标记网状电子设备的原始位置。
9. 通过将注射泵设置为低速并按下 Start（开始）来启动流速。10 mL/h 是 400 μm 内径毛细管针的典型起始流速。如果网状电子探针在针内不移动，请缓慢增加流速。
   注意:尽量减少注入大脑的液体量很重要，因为这会损害注射部位周围的组织。每 1 mm 进样网孔长度的进样体积小于 25 μL 时，可获得最佳结果。理想值小于此体积的一半;在我们的实验室中，我们通常每 4 mm 注射网孔长度注射 10-50 μL。
10. 当网状电子探头开始在针头内移动时，使用立体定位框架以与网状电子探头注射相同的速度缩回针头，以网状电子探头的标记原始位置为导向。
    注意:该程序称为视野 （FoV） 注射方法，允许将网状电子设备精确输送到目标大脑区域，而不会起皱或脱臼。通常，一旦网状电子探针开始在针内移动，流速就会降低。在我们的实验室中，通常需要 20-30 mL/h 的流速来克服网片和毛细管针壁之间的静摩擦，但一旦注射过程开始，流速可以降低到 10 mL/h。对于较小直径的毛细管针头，流速和进样体积通常较小。
11. 继续流出生理盐水并缩回针头，直到针头离开颅骨。停止注射泵的液流。

2. 输入/输出接口

注意:此时，网状电子探针已沿所选轨迹从大脑内所需的起点注入。针头已缩回，位于开颅手术的正上方，网状电子互连从大脑跨越到针头，输入/输出 （I/O） 垫仍在针头内（图 4B）。本节使用印刷电路板 （PCB;图 4、图 5）连接到网状电子探针。PCB 通过绝缘基板将 ZIF 连接器连接到 32 通道标准放大器连接器，该绝缘基板成为神经记录实验的头级。PCB 可定制，以适应各种头级配置。我们的设计文件可应要求提供，也可从资源网站 meshelectronics.org 获得，可用于从 PCB 制造和组装服务供应商处以低廉的价格购买 PCB。

1. 使用立体定位框架小心地将针头引导到 FFC 夹紧基板并穿过间隙，用注射泵流动溶液，在网状电子互连中产生松弛（图 4C）。
2. 一旦针位于夹紧基板上方并穿过间隙，以快速恢复流动，将网状电子 I/O 焊盘弹出到夹紧基板上（图 4D）。
3. 使用镊子和去离子水 （DI） 移液器，将 I/O 焊盘弯曲至约 90° 角，尽可能靠近第一个 I/O 焊盘。
   注意:弯曲是必要的，以便在后续步骤中将焊盘插入 PCB 上的 ZIF 连接器中。ZIF 连接器的宽度与网状电子探针的 32 个 I/O 焊盘的宽度完全相同，因此不完美的 90° 弯曲，或者弯曲不是在第一个 I/O 焊盘之前发生，将导致必须切断 I/O 焊盘（图 4E 中最左侧的焊盘）。
将
4. I/O 焊盘对齐、展开并与网杆成 90° 角后，用轻轻流动的压缩空气将其干燥就位。
   注意:少于 32 个通道的网状电子探针可以与相同的 32 通道接口板连接。例如，我们的实验室通常使用 16 通道网状电子探针和 32 通道 PCB。这在 ZIF 连接器内提供了额外的空间，使接口更容易，并且在录制过程中通过阻抗测试，可以很容易地将额外的未接触通道识别为开路。
5. 在距离 I/O 焊盘边缘约 0.5-1 mm 的直边处切割夹紧基板。还要剪掉夹紧基板的外来部分，这些部分会阻碍插入 PCB 安装的 32 通道 ZIF 连接器（图 4F）。
6. 将 I/O 焊盘插入 PCB 上的 ZIF 连接器并关闭闩锁（图 4G）。使用测量电子设备测量通道和接地螺钉之间的阻抗，以确认连接成功。如果阻抗值过高，请解锁 ZIF 连接器，调整插入，然后重新测试，直到确认连接成功。
7. 用牙科粘结剂覆盖 ZIF 连接器和外露的网状电子互连器以提供保护。在基板的间隙处翻转 PCB，然后用水泥将 PCB 固定在鼠标头骨上（图 4H）
   注意:在间隙处弯曲 FFC 可以减少有时会破坏网状电子互连的机械应力。
8. 让水泥硬化，将 PCB 变成一个坚固、紧凑的头级，以便在随后的录制过程中进行接口（图 4I）。

3. 神经记录实验

1. 将鼠标放在尾翼或其他限制器中。将前置放大器 PCB 插入头部 stage PCB 上的标准放大器连接器。使用单独的电缆将参考螺钉接地。
2. 对于受限制的录音，请将鼠标留在限制器中。使用数据采集系统记录所需时间段的数据（图 5A）。
3. 对于自由移动的录音，请在插入前置放大器 PCB 并将参考螺钉接地后，将鼠标从限制器中释放。当鼠标自由行动时，使用数据采集系统记录所需的时间长度（图 5B）

结果

图 1:即插即用网状电子设备的照片和光学显微镜图像。（A） 具有即插即用 I/O 的注射器注射网状电子探针的平铺光学显微镜图像。在图 2 中的制造步骤完成后，但在从 Ni 涂层衬底释放之前，对探针进行成像。虚线框从左到右对应于分别以 C、D 和 E 放大的超灵活器件区域、字干和 I/O 区域的各个部分。比例尺 = 1 mm。（B） 包含 20 个完整的网状电子探针的 3 英寸硅晶片的照片。比例尺 = 20 mm。（C） 直径为 20 μm 的 Pt 记录超柔性器件区域中电极的光学显微镜图像。比例尺 = 100 μm。（D） 茎区域中高密度 Au 互连的光学显微镜图像。每个 Au 互连都是电气隔离的，并将单个 Pt 电极连接到单个 I/O ...

材料