用于小鼠大脑稳定单神经元记录的可注射网状电子器件

摘要

来源：Schuhmann Jr., T. G.，等。可注射式网状电子器件用于稳定慢性啮齿类动物电生理记录。J. Vis. Exp. (2018)。

该视频展示了将网状电子探针注入小鼠脑内，以实现单个神经元水平的稳定长期记录。将已麻醉且颅骨暴露的小鼠固定在立体定位仪上，通过颅骨钻孔将探针的网状装置区域注入脑内。探针的输入-输出焊盘连接至电路，并通过数据采集系统获取记录信号。

方案

1. 将网状电子器件立体定位注射至活体小鼠脑内

注意：小鼠通过腹腔注射75 mg/kg氯胺酮和1 mg/kg右美托咪啶的混合物进行麻醉。手术开始前，采用脚趾夹捏法确认麻醉深度。麻醉期间，将小鼠置于37 °C恒温毯上以维持体温。手术过程中严格执行无菌操作，包括但不限于：所有金属手术器械在使用前经高压灭菌1小时，佩戴无菌手套，术中持续使用热珠灭菌器，维持手术区域的无菌环境，用70%乙醇对塑料器械进行消毒，以及在切口前用碘伏处理脱毛的头皮皮肤。对于可存活手术，手术结束后在伤口周围涂抹抗生素软膏，并将小鼠放回配备37 °C加热垫的笼子中。在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。术后72小时内，每12小时通过腹腔注射给予0.05 mg/kg体重的布托啡诺镇痛。手术后小鼠与其他动物隔离饲养。小鼠通过腹腔注射270 mg/kg体重的戊巴比妥钠或经心脏灌注法实施安乐死。

1. 麻醉小鼠，并将其固定在立体定位仪上。
2. 在小鼠眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 使用牙科钻和立体定位仪，在颅骨的预定坐标处开颅，形成一个颅骨窗；另在远离注射位点的位置再开一个颅骨窗，用于植入不锈钢接地螺钉或导线。
4. 用牙科水泥将夹持基板固定在颅骨上。在基板上切出一个约1 mm宽的缝隙，以提高后续操作中折叠步骤的可靠性。
   注意： 将扁平柔性电缆（FFC）裁剪成“L”形效果良好（图4A），尽管许多材料均可使用，只要其厚度适合32通道零插入力（ZIF）连接器即可（设计用于厚度为0.18 ± 0.05 mm的电缆）。
5. 使用直角末端夹具将装有含网状电子器件针头的移液器支架固定在立体定位仪上（图2C 和 图3A）。
6. 将移液器支架的侧向出口通过长约0.5–1 m的毛细管连接至安装在注射泵上的5 mL注射器（图3D）。
   注意： 在将毛细管连接至移液器支架前，务必确保其中无气泡。气泡可能在注射过程中中断液体流动，导致网状电子器件无法平稳、可控地递送。
7. 使用立体定位仪将针头尖端定位至脑内预定起始位置。
   注意： 此处使用的网状电子探针设计为记录电极沿约2 mm长度分布，第一个电极位于网状电子器件起始边缘（图1A中最左侧边缘）约0.5 mm处。因此，立体定位坐标应选择为比目标脑区深0.5 mm的位置。记录电极在网状电子结构内的分布和位置可在掩模设计过程中自由设定，应确保在沿立体定位轨迹注射时，记录电极能够覆盖目标脑区（或多个脑区）。
8. 调整摄像头位置（图3B），使其能够显示玻璃针头内网状电子探针的顶端。某些软件允许用户在屏幕上画线，标记网状电子器件的原始位置。
9. 将注射泵设置为低速并启动，开始推动液体流动。对于内径为400 µm的毛细针，10 mL/h 是典型的起始流速。若网状电子探针在针内未移动，可缓慢增加流速。
   注意： 必须尽量减少注入脑内的液体体积，因为过多液体可能损伤注射部位周围的组织。每注射1 mm长度的网状结构，注入体积小于25 µL时效果最佳；理想值应低于此体积的一半。在本实验室中，通常每注射4 mm长度的网状结构，注入10–50 µL生理盐水。
10. 当网状电子探针开始在针内移动时，以与探针推进速度相同的速度，使用立体定位仪同步回撤针头，并以标记的网状电子器件原始位置作为参考。
    注意： 该操作方法称为视场（FoV）注射法，可实现网状电子器件向目标脑区的精确递送，避免折叠或移位。通常在网状电子探针开始移动后可降低流速。在本实验室中，初始流速常需20–30 mL/h以克服网状结构与毛细针壁之间的静摩擦力，但一旦注射启动，流速即可降至10 mL/h。对于更小内径的毛细针，通常需要更低的流速和注射体积。
11. 持续灌注生理盐水并回撤针头，直至针头完全退出颅骨，随后停止注射泵的液体流动。

2. 输入/输出接口

注意： 此时，网状电子探针已从大脑内选定的起始点沿预定轨迹注射到位。注射针已回撤至颅骨开孔上方，网状电子器件的互连部分从大脑延伸至注射针，而输入/输出（I/O）焊盘仍位于针内（图4B）。本步骤使用印刷电路板（PCB；图4、图5）与网状电子探针进行连接。该PCB通过绝缘基板将零插入力（ZIF）连接器与32通道标准放大器连接器相连，构成神经记录实验的前置放大头戴装置（head-stage）。PCB可根据不同头戴装置配置进行定制。我们的设计文件可根据请求获取，或从资源网站 meshelectronics.org 下载，并可用于向PCB制造与组装服务供应商低成本采购PCB。

1. 使用立体定位仪小心引导针头到达FFC夹持基底并跨越间隙，同时通过注射泵输送溶液，使网状电子器件的互连部分产生松弛（图4C）。
2. 当针头位于夹持基底上方并跨越间隙后，恢复快速流速，将网状电子器件的I/O焊盘喷射到夹持基底上（图4D）。
3. 使用镊子和去离子水（DI）移液器，将I/O焊盘弯曲至约90°角，弯曲位置应尽可能靠近第一个I/O焊盘。
   注意： 弯曲操作是必要的，以便在后续步骤中将焊盘插入PCB上的ZIF连接器。ZIF连接器的宽度与网状电子探针的32个I/O焊盘完全相同，因此若弯曲角度偏离90°，或弯曲位置未紧邻第一个I/O焊盘，则可能导致需要切除部分I/O焊盘（如图4E中最左侧的焊盘）。
4. 当I/O焊盘对齐、展开并垂直于网状主干呈90°角后，用轻柔流动的压缩空气原位干燥。
   注意： 通道数少于32的网状电子探针也可使用相同的32通道接口板进行连接。例如，我们实验室通常将16通道的网状电子探针与32通道的PCB配合使用。这可在ZIF连接器内提供额外空间，使连接更便捷，并且在记录过程中可通过阻抗测试轻松识别未连接的额外通道为空开路。
5. 在距离I/O焊盘边缘约0.5–1 mm处沿直线切割夹持基底。同时切除可能妨碍插入PCB上32通道ZIF连接器的夹持基底多余部分（图4F）。
6. 将I/O焊盘插入PCB上的ZIF连接器，并关闭锁扣（图4G）。使用测量电子设备测量各通道与接地螺钉之间的阻抗，以确认连接成功。若阻抗值过高，应打开ZIF连接器锁扣，调整插入位置后重新测试，直至确认连接成功。
7. 用牙科水泥覆盖ZIF连接器及暴露的网状电子器件互连部分以提供保护。在基底间隙处翻转PCB，并用牙科水泥将其固定在小鼠颅骨上（图4H）。
   注意： 在间隙处弯曲FFC可减少可能损坏网状电子器件互连部分的机械应力。
8. 让牙科水泥固化，使PCB成为坚固紧凑的头部接口装置，用于后续记录会话中的信号连接（图4I）。

3. 神经记录实验

1. 将小鼠放入尾静脉固定器或其他固定装置中。将前置放大器PCB插入头级PCB上的标准放大器连接口。使用单独的导线将参考螺钉接地。
2. 对于固定状态下的记录，保持小鼠处于固定装置中。使用数据采集系统记录所需时长的数据（图5A）。
3. 对于自由活动状态下的记录，在插入前置放大器PCB并完成参考螺钉接地后，将小鼠从固定装置中释放。在小鼠自由活动的同时，使用数据采集系统记录所需时长的数据（图5B）

结果

图 1：即插即用型网状电子器件的照片与光学显微镜图像。（A）带有即插即用输入/输出端口（I/O）的可注射式网状电子探针的拼接光学显微图像。该探针在完成 图 2 所示的全部 fabrication 步骤后、但尚未从镍涂层基底上释放时成像。虚线框从左至右分别对应超柔性器件区域、茎部和 I/O 区域，其放大图分别显示于 C、D 和 E 中。比例尺 = 1 mm。（B）包含 20 个已完成的网状电子探针的 3 英寸硅片照片。比例尺 = 20 mm。（C）超柔性器件区域内直径为 20 µm 的铂记录电极的光学显微镜图像。比例尺...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电动立体定位仪	世界精密仪器公司	MTM-3	小鼠立体定位手术
512通道记录控制器	Intan Technologies	C3004	神经记录系统的一个组件
RHD2132 放大器板	Intan Technologies	C3314	神经记录系统的一个组件
RHD2000 3 英尺超薄 SPI 接口电缆	Intan Technologies	C3213	神经记录系统的一个组件
小鼠固定器	Braintree Scientific	TV-150 STD	标准1.25英寸内径；用于在限制性记录过程中固定小鼠。
玻璃毛细管针	Drummond Scientific Co.		内径 0.40 mm，外径 0.65 mm。其他规格直径亦可提供。
U型微量移液器架	Molecular Devices, LLC	1-HL-U	用于在立体定位注射过程中固定玻璃毛细针
1 mL 注射器	NORM-JECT®，Henke Sass Wolf		用于将网状电子器件手动装入毛细玻璃针
聚乙烯颅内导管管路	Becton Dickinson and Company		内径 1.19 mm，外径 1.70 mm
5 mL 注射器	贝克顿·迪金森公司		用于注射泵中，以实现网状电子器件的体内注射
目镜相机	Thorlabs 公司	DCC1240C	用于在注射过程中观察毛细管针内的网状电子器件
用于USB相机的ThorCam uc480图像采集软件	Thorlabs 公司		用于在注射过程中观察毛细管针内的网状电子器件
注射泵	哈佛仪器公司	PHD 2000	用于在注射网状电子器件时，通过毛细管针精确输送溶液体积
EXL-M40 牙科钻机	Osada	3144-830	用于钻取颅骨窗
0.9 mm 钻头	精细科学工具	19007-09	用于钻取颅骨切开术孔洞
热珠灭菌器 14 cm	精细科学工具	18000-50	用于灭菌外科器械
CM1950 冷冻切片机	Leica Microsystems		用于将冷冻组织切成切片。许多大学都配备有
直角端部夹具	Thorlabs 公司	RA180/M	用于将移液器架固定到立体定位仪框架上
印刷电路板（PCB）	高级电路		用于在网状电子器件与外周测量电子设备（如Intan记录系统）之间建立连接。Advanced Circuits及其他供应商提供此类 根据提供的设计文件组装印刷电路板。我们的印刷电路板设计文件可通过申请或访问资源网站 meshelectronics.org 获取
32通道标准放大器连接器	Omnetics Connector Corp.	A79024-001	组件安装到PCB上
32通道扁平柔性电缆（FFC）	Molex, LLC	152660339	用作将网格电子器件的I/O焊盘与印刷电路板上安装的ZIF连接器对接时的夹紧基底
32通道零插拔力（ZIF）连接器	Hirose Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	组件安装到印刷电路板上