建立脑片电生理记录的全细胞电压钳制配置

摘要

来源：Sunstrum, J. K., 等. 利用全细胞膜片钳电生理技术评估突触多重性. J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了如何将尖端精细的移液管置于脑切片附近，与神经元细胞形成封接。通过施加负压使细胞膜破裂，从而建立全细胞膜片钳，以实现电生理实验中的电流测量。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 溶液

1. 切片溶液​
   1. 参见 表1 用于切片溶液的配制。
   2. 提前配制20x储存液，并于4℃保存 °最多可于 C 保存 1 个月。
   3. 对于1×切割溶液，将NaHCO₃溶解于₃，葡萄糖和蔗糖在ddH₂O中₂O，并加入20倍浓缩储备液。确保溶液渗透压在315至320 mOsm之间，4℃保存不超过1周 °C.
   4. 将两个烧杯各装入 100 mL 切片液，并用封口膜覆盖。将溶液置于 -80 °C 超低温冰箱中冷却至部分结冰状态（约 20 分钟）。 °C冷冻机）。使用气体分散管，在冰上将两烧杯切片液用95% O2/5% CO2混合气体通气20分钟。
2. aCSF（人工脑脊液），用于脑片恢复与维持
   1. 参考 表1 用于 aCSF 的配制。
   2. 提前配制20x储存液，并于4℃保存 °C，最长可保存1个月。
   3. 对于1x aCSF，将NaHCO3和葡萄糖溶解于ddH2O中，然后加入20x储备液。确保渗透压在298–300 mOsm之间。溶液需在1天内使用完毕。
3. aCSF（低Ca）²⁺ 用于记录
   1. 参见 表1 低钙成分²⁺ aCSF
   2. 提前配制20x储存液，并于4℃保存 °最多可于 C 保存 1 个月。
   3. 对于1x低钙²⁺ aCSF：将 NaHCO₃ 和葡萄糖溶解于 ddH₂O 中，加入 20x（不含 CaCl₂ 和 MgCl₂）储备液，以及指定浓度的 CaCl₂ 和 MgCl₂。确保渗透压在 298–300 之间。溶液需在 1 天内使用完毕。
4. aCSF (Sr²⁺ 用于记录
   1. 参见 表1 Sr的组成²⁺ aCSF
   2. 提前配制 20x 储存液，并于 4 ℃ 保存 °最多可于 C 保存 1 个月。
   3. 对于1x Sr²⁺ aCSF：将 NaHCO₃ 和葡萄糖溶解于 ddH₂O 中，加入 20x（不含 CaCl₂ 和 MgCl₂）储备液、SrCl₂ 和 MgCl₂ 至指定浓度。确保渗透压在 298–300 之间。溶液需在 1 天内使用完毕。
5. 内液
   1. 参考 表1 用于K-葡萄糖酸盐为基础的内液配制。
   2. 加入15 mL分子生物学级水至50 mL离心管中，配制20 mL内液。随后步骤均需在冰上操作。
   3. 提前配制以下溶液，用分子生物学级水制成 1 M 的储备浓度。加入（单位：mL）：2.32 K-葡萄糖酸盐，0.24 Na-葡萄糖酸盐，0.20 HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），0.16 KCl，0.05 K₂-EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸钾）β-氨基乙基醚- N,N,N′，N′-四乙酸），0.04 MgCl₂ 加入 50 mL 离心管中。
   4. 加入100 µ0.3 M Na 的 L₃GTP（鸟苷-5′-三磷酸）′三磷酸钠盐
   5. 称取44.08 mg K2 ATP（腺苷5′-三磷酸二钾盐）溶于900 μL HEPES缓冲液中。′-三磷酸二钾盐）置于2 mL 微量离心管中，加入1 mL 分子生物学级水，然后转移至50 mL 管中。
   6. 用 1 M KOH 调节 pH 至 7.2–7.4。确保渗透压在 283–289 mOsm 之间。

2. 切片制备

1. 准备工具
   1. 向恢复室（由一个250 mL烧杯制成，内含4个孔和网状结构）中加入200 mL aCSF，并将恢复室置于水浴中（35℃） °C）。
   2. 用石蜡膜覆盖腔室，并通过玻璃分散管向人工脑脊液（aCSF）持续通入95% O2/5% CO2混合气体，至少20分钟。
   3. 准备好解剖工具（手术刀、弯头精细剪刀、镊子、细毛刷、塑料勺）。
   4. 用60 mL注射器吸取约15 mL步骤1.1.4中的冰冻切片液。
   5. 通过将滤纸放置在孔板盖子上，制备解剖平台。
   6. 将切片室置于冰盒中，并在冰盒内加入冰块。
   7. 通过将一次性刀片固定在刀片架中来设置振动切片机。
   8. 制作移液管时，将巴斯德吸管的尖端折断，并在折断的一端套上一个橡胶吸头。
2. 解剖小鼠脑组织
   1. 将动物置于充满4%异氟烷的麻醉舱中，直至脊髓反射消失。
   2. 使用断头器处死动物并迅速取出脑组织。
      1. 使用22号手术刀片从头侧向尾侧做正中切口。
      2. 从头部两侧横向剥离头皮。
      3. 使用精细剪刀从尾侧向头侧（包括额骨一侧）剪开颅骨，注意避免损伤脑组织。
      4. 用镊子将颅骨片从脑组织上移开，并使用2.1.4步骤中的注射器用15 mL冰冻切片液迅速冷却脑组织。
      5. 将脑组织从颅骨中取出。
      6. 将脑组织放入盛有冰冻切片液（来自步骤1.1.4）且通入95% O2/5% CO2混合气体的烧杯之一中。

3. 准备小鼠下丘脑切片。

1. 针对目标脑区进行脑组织阻断，并按所需角度切割（例如，制备冠状下丘脑切片时，使用刀片切除视交叉前方及脑桥后方的组织，并确保后部组织块的切面与脑底面垂直）。
2. 使用一段滤纸从脑组织前方轻轻托起脑块，并用瞬干胶将脑块后侧粘附于固定板上。
3. 迅速将固定板放入切片室，并加入步骤1.1.4中第二个烧杯内的切片液。
4. 将切片室和冰盘固定在振动切片机上。
5. 设定切片区间（脑组织的前部和后部），开始切制厚度为250 µm的冠状切片。推荐参数：切片速度0.10 mm/s，振幅2 mm。
6. 将切片修剪至目标脑区所需的适当大小。
7. 将切片置于35 °C环境中恢复30–45分钟。随后将恢复室从温浴中取出，在室温下继续恢复30分钟。之后将切片在室温下保存至当日实验结束，并持续以95% O2/5% CO2混合气体通入浴液中进行鼓泡供氧。

3. 全细胞膜片钳记录

1. 拉制膜片电极。​
   1. 根据膜片钳电极拉制仪说明书推荐的全细胞记录参数，使用厚壁玻璃管拉制膜片电极，使其电阻达到 3–5 MΩ。
   2. 使用微量注射器（商用或自制），将过滤后的内液填充至电极尖端。制作微量注射器的方法：将 1 mL 注射器尖端烧熔，使其自然下坠，形成细长的尖端。
2. 获得全细胞记录构型。
   1. 将记录电极置于脑片上方，进入电压钳模式并调节电极电流零点。向电极施加轻微正压，并锁定旋塞阀。
   2. 选择膜结构完整、状态良好的细胞，用电极接近该细胞。施加正压时应在组织中引起轻微扰动（即进入组织时产生缓慢的波动）。
   3. 继续以对角线方式缓慢推进电极，直至电极在细胞表面形成微小凹陷。
   4. 释放正压锁定。细胞将开始形成封接，电阻升至 1 GΩ 以上。在电压钳模式下，将细胞钳制在 -68 mV。
   5. 以对角线方向轻微回撤电极，以释放细胞上的多余压力。
   6. 补偿电极的快速和慢速电容。
   7. 通过连接电极夹持器的管路短暂施加吸力，击穿细胞膜，获得全细胞记录构型。
   8. 在电生理数据采集与分析软件（例如 Clampex）的膜特性测试窗口中切换至“Cell”模式。
   9. 每次电压钳记录前，使用同一软件进行膜特性测试，并在实验记录本中记录相关参数（膜电阻、串联电阻和电容）。
   10. 后续实验中，维持记录浴槽温度在 27–30 °C，灌流速度保持在 1.5–2.0 mL/min。

表1：各种溶液的组成。

	溶液浓度（mM）
	切片	正常 aCSF	低 Ca2+ aCSF	Sr+ aCSF	移液管/内液
NaCl	87	126	126	126	-
KCl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0.5	2.5	0.5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	2
NaH2PO4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
葡萄糖	25	10	10	10	-
蔗糖	75	-	-	-	-
K-葡萄糖酸盐	-	-	-	-	116
Na-葡萄糖酸盐	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0.3

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	BD	309659
10 号刀片	Fisher Scientific/其他	35698
22 号刀片	VWR/其他	21909-626
22 µm 注射器滤器	Milipore	09-719-000
Adson 镊子	Harvard Instruments	72-8547
斜尖精细剪刀	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
双刃刀片	VWR	74-0002
滤纸	Sigma/其他	1001090
细毛刷	Fisher/多种	15-183-35/多种
气体分散管	VWR	LG-8680-120
异氟烷	Fresenius Kabi/其他	M60303
Krazy 胶水	多种	多种
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
渗透压仪	Wescor Inc	Model 5600
Parafilm 封口膜	Sigma	PM-996
巴斯德吸管	VWR	14672-200
pH 计	Mettler Toledo	FE20-ATC
橡胶吸头	VWR	82024-550
3 号手术刀柄	Harvard Instruments	72-8350
4 号手术刀柄	Harvard Instruments	72-8356
单刃刀片	VWR	55411-050
振动切片机	Leica	VT1200S
纯水系统	Millipore	Milli-Q Academic A10
培养板盖	Fisher/多种	07-201-590/多种
CaCl₂·2H₂O	Sigma	C7902
CdCl₂	sigma	202908
EGTA	Sigma	E3889
葡萄糖	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K₂-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-葡萄糖酸盐	Sigma	G4500
MgCl₂·6H₂O	Sigma	M2670
分子生物学级水	Sigma	W4502-1L
Na₃GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-葡萄糖酸盐	Sigma	S2054
NaH₂PO₄	Sigma	71504
NaHCO₃	Sigma	S6014
苦味毒	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
蔗糖	Bioshop	SUC507.1