所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。
1. pHuC_Mermaid 质粒的构建
注意：Mermaid 是一种生物传感器，通过将海鞘（Ciona intestinalis，现称 Ciona robusta）电压感应磷酸酶（Ci-VSP）的电压感应结构域（VSD）与荧光共振能量转移（FRET）荧光基团 Umi-Kinoko Green（mUKG：供体）以及一种单体化的橙色荧光蛋白 Kusabira Orange（mKOk：受体）配对而开发而成。该生物传感器中，膜去极化诱导 VSD 结构域发生构象变化，从而增加供体与受体荧光蛋白之间的空间接近性，进而增强两者之间的能量转移（即提高 FRET 比值）。VSD 可确保该生物传感器高效定位于细胞质膜。通过将 Mermaid 的开放阅读框（ORF）克隆至斑马鱼泛神经元启动子 HuC 的下游，可实现该生物传感器在神经元中的表达（在脊髓中，该信号可在中间神经元和运动神经元中均被检测到）。
- 使用 T3 通用引物和 Mermaid SmaI 引物（5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA），以 Pfu（具有校对功能）DNA 聚合酶对 pCS4+ Mermaid 质粒中的 Mermaid 开放阅读框（ORF）进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，以在 Mermaid ORF 的上游插入一个 SmaI 限制性酶切位点。
- 使用以下 PCR 反应体系：0.5 µL Pfu DNA 聚合酶，7.5 µL 特异性 10x 缓冲液，1 µL 10 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTPs），2.5 µL 二甲基亚砜（DMSO），0.5 µL（50 ng）质粒样品，以及每种引物的 20 µM 储存液各 1 µL，总体积为 50 µL。
- 将 PCR 反应体系在 95 °C 下加热 15 秒，50 °C 下退火 15 秒，72 °C 下延伸 4 分钟，共进行 35 个循环。
- 使用市售凝胶纯化试剂盒，按照制造商的说明书对特异性的平末端 PCR 产物进行凝胶纯化。
- 按照制造商的说明书，将 DNA 片段克隆至 pCMV-SC 平末端载体中。
- 使用 SmaI 限制性内切酶线性化 Mermaid 阳性质粒（命名为 pCMV-SC_Mermaid），以便后续插入 HuC 启动子。
- 设置如下限制性酶切反应体系：0.5 µL（10 U）SmaI 限制性内切酶，2 µL 配套试剂盒的 10x 缓冲液，以及 5 µg 质粒 DNA，总体积为 20 µL。在 25 °C 下孵育反应 1 小时。
- 使用市售凝胶纯化试剂盒，按照制造商的说明书对酶切后的质粒进行凝胶纯化。
- 以斑马鱼基因组 DNA 为模板，使用 Pfu DNA 聚合酶和一对 HuC 特异性引物（HuCprom-forw1_SalI：5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA 和 HuCprom-rev1：5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG），对 HuC 启动子（pHuC）进行 PCR 扩增，扩增区域为 ATG 起始密码子上游 3,150 bp 的片段。
- 按照以下方案配制 PCR 反应体系：0.5 µL Pfu DNA 聚合酶，7.5 µL 特异性 10x 缓冲液，1 µL 10 mM dNTPs，2.5 µL DMSO，200 ng 基因组 DNA，以及每种引物的 20 µM 储存液各 1 µL，总体积为 50 µL。
- 先在 95 °C 下预变性 2 分钟，随后在 95 °C 下变性 15 秒，50 °C 下退火 15 秒，72 °C 下延伸 4 分钟，共进行 35 个循环。
- 使用市售凝胶纯化试剂盒，按照制造商的说明书对特异性的平末端 PCR 产物进行凝胶纯化。
- 将纯化的 pCMV-SC_Mermaid（步骤 1.5）与 pHuC DNA（步骤 1.7）以等摩尔量混合，加入 1 µL T4 DNA 连接酶和 1 µL 特异性 10X 缓冲液，总体积为 10 µL。在 4 °C 下孵育反应 16 小时。
- 按照制造商的说明，取 5 µL 连接反应产物（步骤 1.8）转化感受态细胞。
- 通过 SalI-EcoRV 双酶切筛选启动子正确插入方向的 pHuC 阳性克隆（pHuC_Mermaid）（SalI 限制性酶切位点已在步骤 1.6 中插入启动子片段的上游，而 EcoRV 限制性酶切位点位于 pCMV-SC 质粒的多聚腺苷酸化区域（PolyA）下游）。
- 设置如下限制性酶切反应体系：0.5 µL（10 U）SalI 和 EcoRV 限制性内切酶，2 µL 试剂盒 10X 缓冲液，以及 1 µg pHuC_Mermaid DNA，总体积为 20 µL。在 37 °C 下孵育反应 1 小时，随后将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. 胚胎显微注射
- 使用塑料移液管将从野生型（AB品系）或Sod1-G93R成年斑马鱼获得的受精卵转移至直径10 mm的培养皿中。
- 用预冷（4 °C）的鱼水冲洗胚胎，并立即使用显微注射仪将200 pg的pHUc_Mermaid质粒注射到卵黄中（有关显微注射操作的总体及详细描述）。
- 使用塑料移液管将胚胎转移至培养皿中，在28 °C的鱼水中孵育，直至胚胎发育至所需阶段（受精后20–24小时，hpf），用于后续分析。
3. 自发性尾部卷曲分析
注意：在20-24小时受精龄胚胎中评估是否存在药物利鲁唑时的自发性尾部卷曲行为。
- 将胚胎转移至一个盛有含0.2% DMSO（利鲁唑溶媒）鱼水的90 mm圆形培养皿中，使用尖头镊子手动去除胚胎的卵膜。将胚胎孵育5分钟。
- 在室温（RT）下，使用安装在体视显微镜上的数码相机进行1分钟的视频记录，检测尾部卷曲行为。以每秒30帧的时间分辨率采集时间序列图像。
- 通过计算单位时间内弯曲次数（包括对侧和同侧弯曲），确定自发性尾部卷曲的频率。
- 为评估药物利鲁唑的作用，用塑料巴斯德吸管轻轻将胚胎转移至另一个盛有含5 µM利鲁唑鱼水的90 mm培养皿中。
- 孵育胚胎5分钟后，录制1分钟视频，并按上述方法进行行为分析。
4. 活体胚胎中Mermaid生物传感器成像的实验设置：供体与受体信号的同步检测
- 将20-24 hpf的胚胎置于含1%低熔点琼脂糖的鱼水中，在37 °C条件下放入35 mm玻璃底成像培养皿内。将胚胎侧向摆放。待琼脂糖在室温下凝固。
- 将成像培养皿转移至倒置共聚焦显微镜的载物台上。使用20倍物镜（数值孔径0.7，NA），通过488 nm氩离子激光激发mUKG，记录495–525 nm范围内的发射光，鉴定表达生物传感器的运动神经元。
- 进行FRET测量时，使用488 nm激光激发FRET对中的供体mUKG。同时，采用以8,000 Hz频率双向模式运行的共振扫描器，检测供体发射的荧光（495–525 nm）以及受体mKOk发射的荧光（550–650 nm，FRET通道）。如有条件，可使用473 nm激光。
注意： 供体的激发效率将略有降低（使用473 nm激光线时为85%，而非488 nm时的93%），但受体的交叉激发也会相应减少（从使用488 nm激光时的17%降低至使用473 nm激光时的9%）。
- 为减少光毒性和荧光染料漂白，应通过降低激光线功率（在 光束路径窗口 采集软件的
- 优化激发参数，以匹配实验开始时设定并在整个实验过程中保持恒定的增益和偏移参数。设置偏移时，将图像颜色转换为强度值（使用Q伪彩查找表），在关闭激光器的情况下进行扫描，调节偏移旋钮（smart offset），使背景像素的强度略高于零。使用相同的查找表，在扫描时打开激光器，调节增益旋钮（smart gain），以最大化信噪比，同时注意避免像素饱和。
- 使用开放针孔（2 个艾里单位），采集 16 位图像，以提供足够的动态范围用于定量分析。避免使用平均扫描以提高采集速度并最小化光漂白。
- 在软件采集窗口中，从下拉菜单选择512 × 64像素的图像视野大小（像素尺寸：605 nm）。
- 从采集模式窗口中选择 xyt （单个 xy 平面上的时间延时） f从下拉菜单中选择相应选项，并通过获取单个 xy 平面来记录胚胎脊髓神经元电压的变化，设置采集参数为每 30 毫秒采集一张图像，持续 1 分钟。
- 为评估利鲁唑给药对同一神经元膜去极化的影响，在加入含5 µM利鲁唑的鱼水后5分钟，采集一组新数据集。
- 用于FRET分析时，使用ImageJ宏Biosensor_FRET（用于表达单链FRET生物传感器）。
- 在 t1 时刻评估每个神经元的基底膜 FRET 比值，计算公式为 ((FRET 平均值 - FRET 背景值)/(供体平均值 - 供体背景值))，其中 FRET 和供体的平均荧光强度是在围绕细胞绘制的同一兴趣区域（ROI）内，针对各通道获取的图像计算得出的平均荧光强度；FRET 和供体的背景值则是在视野中无荧光样品区域的 ROI 内计算得到的平均荧光强度。
注意： 有关该插件使用的详细逐步说明，可参见 www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret 网站。
- 使用绘图软件比较不同实验范式下去极化频率、振幅和持续时间的差异。采用非配对 t 检验比较两组间差异。 t-检验并认为当 P 时，平均值在统计学上具有显著差异 <0.05.
