在活体小鼠前肢肌肉中测量复合肌肉动作电位

摘要

来源：Pollari, E. 等人， 体内 小鼠运动神经元变性模型中前肢复合肌肉动作电位的电生理测量 视频实验杂志 (2018).

本视频演示了一种在小鼠体内测量复合肌肉动作电位（CMAP）的技术。该技术概述了电极设置、刺激支配肌纤维的前肢神经元以及记录肌肉反应的步骤。该方法可用于评估神经元脱髓鞘及功能性神经元的丢失。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物准备与麻醉

1. 使用异氟烷/氧气吸入法对小鼠进行麻醉诱导。麻醉诱导时使用4%异氟烷，维持时使用2-3%异氟烷，氧气流速为2.5 L/min。根据小鼠的状况调整麻醉维持期间的异氟烷浓度。 即，体型较小且虚弱的小鼠所需的麻醉剂剂量较低。确认麻醉充分 例如通过轻压后肢行走垫以确认无疼痛退缩反射。
2. 使用37 °C恒温加热板控制小鼠体温，以防止麻醉期间体温下降。
3. 将小鼠戴上鼻罩以维持麻醉状态。通过检查鼻罩是否阻塞气道以及小鼠是否呼吸平稳，确保动物获得充足的氧气供应。
4. 记录过程中，通过观察小鼠的呼吸频率（麻醉状态下约为1 Hz）以及轻压时是否缺乏缩足反射，来监测其麻醉深度。若麻醉深度不足，需手动提高异氟烷浓度。
5. 测量结束后，将小鼠置于加热板上或红外灯的温暖环境中恢复，直至其意识恢复到能够维持胸卧位，大约需要2-5分钟。在小鼠完全从麻醉状态恢复之前，不得将其单独留下或与其他小鼠放在一起。

前肢复合肌肉动作电位的测量

1. 使用27 G针状电极进行前肢复合肌肉动作电位（CMAP）测量。电极放置位置参见图1。
2. 按以下步骤将电极放置于前肢：
   1. 将小鼠仰卧置于加热垫上，并用胶带将其双侧前肢向身体两侧伸展固定（图1B）。
   2. 将刺激电极（1 = 阳极，2 = 阴极）皮下插入前肢两侧，使其与臂丛神经对齐。提起皮肤，将针头垂直刺入皮肤，并将约5 mm针体推入皮下，注意避免刺穿下方肌肉组织。
   3. 通过提起皮肤，将记录电极（3）置于肱二头肌上方皮下。将参考电极（4）以30度角插入足垫，深度为3 mm。将接地电极（5）置于小鼠体侧皮下。
      注意： 此设置中各电极彼此靠近。应防止电极相互接触，以免干扰记录信号。

3. 数据采集

1. 通过按下控制器单元上的recurrent stimulus按钮开始刺激，并旋转强度控制旋钮以增加刺激强度。使用1脉冲/秒、0.1毫秒刺激持续时间来刺激所有轴突。在软件中从下拉菜单选择正确的频率和持续时间。
2. 为达到超强刺激（5–20 mA；在脱髓鞘条件下可高达60 mA），通过旋转强度控制旋钮逐步增加刺激，直至复合肌肉动作电位（CMAP）反应的幅度不再增加。在此基础上再将刺激强度提高20%，以确保CMAP幅度已达到最大反应。再次按下recurrent stimulus按钮结束刺激。
3. 使用标记工具在记录中标识以下时间点：刺激起始、反应起始、最大正向波峰和最大负向波峰（Figure 2）。
4. 潜伏期（以毫秒计）定义为从刺激起始到反应起始之间的延迟（Figure 2）。将反应起始定义为幅度开始上升的最早时间点。利用潜伏期评估轴突的脱髓鞘情况。
5. 测量从最大负向波峰到最大正向波峰之间的幅度（mV）（Figure 2）。通过幅度大小来推断功能性轴突的数量。

结果

图1. CMAP测量中电极的放置位置。 图中展示了后肢（A）和前肢（B）的电极位置。电极编号如下：1：阳极刺激电极，2：阴极刺激电极，3：记录电极，4：参考电极，以及5：接地电极。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可重复使用的皮下针电极，铂/铱合金	Technomed	TE/S61-434	针长13 mm (0.51")，直径0.4 mm (27G)
Natus神经电生理诊断系统	Natus Neurology	UltraPro S100	肌电图设备
Synergy	Natus Neurology	版本 20.1.0.100	UltraPro S100配套的肌电图软件
Physitem Controller	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV	加热垫
combi-vet 基础麻醉系统 数字流量计 配备TEC 3蒸发器	Rothacher & Partner	CV 30-301-D	异氟烷蒸发器及流量计
Iso-Vet 1000 mg/g	Piramal Healthcare UK Limited	AP/DRUGS/220/96	异氟烷
SOD1-G93A 小鼠	The Jackson Laboratory	#002726	肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠及非转基因对照同窝仔鼠，仅雌性
PrP-hFUS-WT3 小鼠	The Jackson Laboratory	#017916	肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠及非转基因对照同窝仔鼠，各组雄性和雌性数量均衡
C57BL/6Jax 小鼠	The Jackson Laboratory	#000664	用于轴突切断实验的非转基因小鼠，包含雄性和雌性
C61-PMP22 小鼠	该小鼠品系由德国哥廷根马克斯·普朗克实验医学研究所M. Sereda教授慷慨赠送。		腓骨肌萎缩症转基因小鼠及非转基因对照同窝仔鼠，各组雄性和雌性数量均衡