电压响应的电生理记录 黑腹果蝇 视网膜光感受器对光刺激的反应

摘要

来源：Juusola, M., 等 记录细胞内电压反应的电生理学方法 黑腹果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 体内. J. Vis. Exp. (2016).

本视频概述了在固定状态的黑腹果蝇（Drosophila）眼部进行光感受器活动电生理记录的实验方案，可实现对光刺激下电压变化的精确测量。

方案

1. R1-R6 光感受器的记录

1. 操作微电极放大器时，务必保持接地（例如触摸法拉第笼或防震台的金属表面），以防止意外将静电传递至前置放大器，从而损坏电路。
2. 使用两个鹅颈导光管（图1A）从上方照射果蝇制备平台的立柱（冷光源置于法拉第笼内），以便在良好视觉控制下将果蝇固定器放置在立柱上的理想位置。
3. 将果蝇固定器（内含果蝇！）安装到果蝇制备平台的立柱上。旋转果蝇固定器，使果蝇的左眼正对实验操作者（图1B）。
4. 在体视显微镜下观察制备过程，使用小型粗调微操纵器，将钝头参考电极轻柔地穿过果蝇的单眼插入头壳内（图1C）。切勿将电极插入过深，以免损伤果蝇脑组织。
   1. 或者，可将参考电极插入胸部背面。务必确保果蝇状态健康（如触角可活动），且其复眼完整，未受意外损伤。若制备状态不佳，应更换新的果蝇进行实验。
5. 将尖锐的记录微电极穿过覆盖有石蜡油的小孔插入左眼。使用体视显微镜的高倍放大功能，并调整导光管和焦平面，使电极尖端通过其反射光模式在三维空间中清晰可见。
   注意：图1D展示了进行光感受器记录时果蝇头部的正确位置（相对于记录电极进入眼睛的角度）。将电极插入眼睛而不使其破裂是实验中最困难的步骤。若电极尖端未对准眼睛上的小孔而撞击角膜，通常会导致电极断裂。
6. 当两个电极均牢固插入制备样品，并与果蝇体液形成良好电接触后，开启微电极放大器。
7. 关闭法拉第笼内的冷光源，并将其从电源插座拔下，将插头连接至中央接地端，以最小化由接地环路引起的电噪声。随后移开鹅颈导光管，以便卡丹臂系统可在果蝇周围自由移动。关闭室内照明，确保果蝇制备处于相对黑暗的环境中。
8. 测量眼内记录电极的电阻。仅使用电阻在100–250 MΩ范围内的记录电极。
   注意：使用<70 MΩ的电极几乎不可能获得高质量的细胞内记录。若电阻<80 MΩ，很可能电极尖端已断裂。此时应关闭放大器并更换记录电极。
9. 将放大器设置为电流钳（CC）或桥式记录模式。由于两个电极目前均处于电学连通的细胞外空间，需将信号偏移（记录电压）调零，以消除记录电极与参考电极之间的任意电压差。可通过放大器的显示屏或示波器屏幕监测信号偏移的变化。
10. 等待2–3分钟，使果蝇眼睛完成暗适应。
11. 以0.1至1微米的小步长，将记录电极尖端进一步深入眼内。可通过遥控微操纵器的X轴压电步进器，或轻柔旋转手动操纵器的精细调节旋钮来实现。
12. 在推进记录电极的同时，用短暂（1–10毫秒）的光脉冲刺激果蝇眼睛。
    注意：若记录电极位于视网膜内且眼睛功能正常，每次光刺激将引起电压的短暂小幅下降（0.2–5 mV的超极化），称为视网膜电图（ERG）。这种细胞外空间场电位的变化源于视网膜细胞对光的集体反应。

结果

图 1. 实验中果蝇固定装置与电极的位置。（A-B） 果蝇固定装置置于记录平台上，该平台通过帕尔贴元件实现温度控制（A：中央白色圆形平台）。万向臂可精确调节光刺激的位置，使光源（液态或石英光纤束末端）与果蝇保持等距，并正对果蝇复眼。在我们的许多实验装置中，光刺激由发光二极管（LED，配备线性电流驱动器）或单色仪产生，因此刺激光具有特定的（带通滤光）光谱成分，波长范围为 300 - 740 nm，光强范围覆盖 4 - 6 个对数单位（通过独立的中性密度滤光片衰减调节）。（C）两个微电极由独立的显微操作器控制，插入果蝇头部：参考电极（上方）穿过小眼；记录电极（左侧）穿过左眼的小开口。（D）为了获得最大数量的光感受器记录，记录微电极沿吻部-小眼轴线平行插入孔中。当电极尖端穿入并密封至某一光感受器时，可自由旋转的光源被固定在该细胞对特定光刺激产生最大电压反应的位置。该空间位置即为该细胞感受野的中心。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于制作果蝇标本的体视变焦显微镜	Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF 目镜：WHN30x-H/22	可实现约150倍放大，工作距离长；定制重型钢制台式支架
体视显微镜在细胞内实验装置中的应用	· 奥林巴斯	奥林巴斯 SZX7；目镜：WHN30x-H/22	需要30倍目镜，以便在将电极穿过角膜小孔插入眼内时，清晰观察电极尖端的反射。
尼康显微镜	尼康 SMZ645；目镜：C-W30x/7
防振台	Melles Griot	面包板上带有 M6 公制螺孔	我们定制的装置在厚光具座上钻有一个大孔，用于从下方穿入果蝇准备平台的支撑杆（内含带电子元件的铜制散热器）
纽波特
显微操作仪	Narishige	Narishige NMN-21	在我们的细胞内记录装置中，使用了不同的显微操作器系统来驱动尖端记录电极进入果蝇复眼。所列出的所有操作器均能成功实现对黑腹果蝇光感受器细胞和大细胞（LMCs）的长时间稳定记录。
Huxley Bertram	Huxley xyz轴精细手动控制
Sensapex	Sensapex 三轴系统
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K 配备附加的 x 轴压电步进器和 MS 314 控制器
磁力架	任何带开关的磁力底座均可使用		例如，用于管理法拉第笼内部的线缆
电极夹持器	哈佛仪器	ESP/W-F10N
银线	World Precision Instruments	AGW1510	0.3 - 0.5 mm 直径；电极夹需进行氯化处理
光纤光源	多种不同品牌，包括 Olympus
光纤束	超精细技术		为向万向节臂系统传递LED光刺激，我们使用液体和石英光导纤维（波长范围从紫外到红外）。
索恩实验室
果蝇捕捉管		P80-50P 50 ml 离心管，聚丙烯材质，100 个/包	从50 ml塑料离心管上切下锥形底部，并在其上粘接一个1 ml移液器吸头。
数字采集系统	国家仪器公司
单电极电流/电压钳制微电极放大器	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ products/amplifiers/sec-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	表现卓越！
头部固定装置	标准（±150 nA）	对于 npi SEC-10LX
LED 光源与驱动器	2通道OptoLED（Cairn Research Ltd.，英国）		我们的许多刺激系统均为自主研制
自行设计与构建
数据采集与分析软件	众多公司可供选择		Biosyst；Juusola 实验室用于实验与理论研究的定制化基于 Matlab 的系统
个人电脑或 Mac			确保计算机（PC 或 Mac）与数据采集系统及软件兼容
万向节系统	自行设计与构建		提供光刺激的精确 x、y、z 位置定位
帕尔帖温度控制系统	自行设计与构建
法拉第笼	自建		电磁噪声屏蔽
细丝状硼硅酸盐玻璃毛细管		外径：1 mm
内径：0.5 - 0.7 mm
细丝状石英玻璃毛细管		外径：1 mm
内径：0.5 - 0.7 mm
拉针仪	Sutter Instrument Company	Model P-2000 激光 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	对于硼硅酸盐参比电极，使用预设程序#11（膜片电极）：加热 = 350； 细丝 = 4；速度 36；延迟 = 200）。1.2.1）对于硼硅酸盐记录电极，使用预设程序#12（该程序通常可拉制出适用于光感受器记录的良好常规尖电极）：加热值 = 355；灯丝 = 4；速度 = 50；延迟 = 225；拉力 = 150。对于需要更细电极尖端的LMC记录，需调整这些参数。对于拉制石英毛细管，P-2000手动装置建议使用相应程序 尖端精细的微电极。这些程序的预设参数可作为有用的起始点 用于系统性修饰，以制备穿透成功率高且记录噪声低的电极。
参比电极用细胞外林格溶液	Fisher Scientific 公司的化学品	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, 蔗糖	参见方案部分的配方
用于填充细丝状记录微电极的 3 M KCl 溶液	Fisher Scientific 公司的盐类	10010310，KCl
凡士林	凡士林