在固定斑马鱼幼体中监测传入神经元的电信号

摘要

来源：Lunsford, E. T.，等. 斑马鱼游泳过程中后侧线传入神经元的活动。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了通过将微吸管置于瘫痪斑马鱼幼虫的侧线神经节附近并形成松密封接来记录传入神经元电信号的方法。在此过程中，细胞外溶液可维持神经元的活性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 电生理记录所需材料的准备

1. 制备硅胶弹性体底部的记录培养皿。
   1. 将一层薄薄的自混合型硅胶弹性体组分（例如 Sylgard）滴加至底部为盖玻片的组织培养皿中，直至其液面与浅井边缘齐平。约 0.5 mL 即可。
   2. 盖上盖子，在室温下固化至少 48 小时。
2. 制备解剖针。
   1. 使用直流电源，将蚀刻液（3M KOH）盛于 100 mL 烧杯中并接负电极（5 V），将一根钨丝（直径 0.002 英寸；50.8 µm）连接至正电极输出端。
      ​警告：在该操作过程中，正负极导线不得相互接触，否则可能产生火花，存在引发火灾的潜在风险。
   2. 通过在蚀刻液中快速反复浸入钨丝尖端，使其逐渐变细至尖锐点状。在体视显微镜下，使用直边剃刀刀片从尖端起约 1 mm 处切断钨丝。重复此过程三次，然后使用精细镊子将针插入已固化的记录培养皿中。
3. 准备记录电极。
   1. 使用配备盒状灯丝的水平微电极拉制仪，将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（内径：0.86 mm，外径：1.50 mm）拉制成电极，使其尖端直径为 30 µm，并具有轻....

结果

图1：后侧线传入神经元与腹侧运动根活动的同时电生理记录。（A）松散贴附式传入神经（i）和腹侧运动根（ii）记录电极的示例。比例尺为50 µm。（B）将幼年斑马鱼麻痹后，用四个位置的针（交叉符号）固定于Sylgard培养皿中，以确保记录稳定性。加粗的交叉符号表示固定针的插入点。（C）电生理装置安装在防震台上，包含一台可进行40倍放大、由电机控制器调节的直立式固定载物台显微镜。双通道电流钳和电压钳前置放大器安装在微操纵器上。（D）体壁肌节由肌隔膜.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mL 烧杯	PYREX	1000	酸蚀剂容器
10倍水浸物镜	Olympus	UMPLFLN10xW	低倍镜用于定位幼虫和记录电极
40倍水浸物镜	奥林巴斯	LUMPLFLN40XW	高倍放大以定位电极尖端并建立膜片钳
BNC同轴电缆	ThorLabs	2249-C-12	连接放大器和数字化器通道；需要4个
带纤维丝的硼硅酸盐玻璃毛细管	Warner Instruments	G150F-3	内径：0.86，外径：1.50；用于制备记录电极的毛细玻璃管
计算机	N/A	N/A	任何计算机均可使用
直流电源	天马	72-420	用于电蚀刻解剖针
电生理学数字转换器	Axon Instruments，Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	可实现膜片钳数据的采集
丝状结构	Sutter Instrument Company	FB255B	微移液管拉制仪中使用的2.5 mm盒装灯丝
精细镊子	Fine Science Tools	Dumont #5（0.05 × 0.02 mm）货号 11295-10	用于操作幼虫并插入针具
固定载物台微分干涉相差显微镜	奥林巴斯	BX51WI	用于观察和建立膜片钳记录的显微镜
柔性锥形移液管吸头	Fisher Scientific	02-707-169	柔性尖端可插入记录电极，以便在尖端处释放细胞外溶液
FluoroDish	World Precision Instruments 公司	FD3510-100	盖玻片底部培养皿记录皿
KimWipe	KimTech	34155	用于吸除幼虫多余液体的擦拭任务
Kwik-Gard	World Precision Instruments 公司	710172	自混合Sylgard弹性体
微电极放大器	Axon Instruments，Molecular Devices	MultiClamp 700B	用于双通道记录的膜片钳放大器
显微操作仪	Narishige	MF-830 微型玻璃拉针仪	抛光记录电极
显微操作仪控制单元	锡斯基尤	MC1000-eR/T	用于控制显微操作仪的四轴旋钮控制器
微移液管拉制仪	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	用于将玻璃毛细管拉制成记录电极
显微镜控制单元	锡斯基尤	MC1000e	将显微镜置于固定载物台及其制备样品周围
电动显微操作器	锡斯基尤	MX7600	定位头架及相连的记录电极，用于膜片钳记录
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	可从 Axon MultiClamp 700B Commander 下载页面获取
光学气浮平台	Newport Corporation	VH3036W-OPT	面包板式隔振台，用于悬浮显微镜并减少记录过程中的振动
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	可从 Axon pCLAMP 10 膜片钳电生理数据采集系统下载 & 分析软件下载页面
培养皿	Falcon	35-3001	用于将幼虫浸入麻痹剂中
移液器架	Molecular Devices	1-HL-U	手持记录电极并连接至前置放大器
气动换能器	福禄克生物医学仪器	DPM1B	用于控制记录电极内部压力
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	221473-25G	用于蚀刻解剖针的蚀刻剂
硅胶管	Tygon	14-169-1A	连接气动换能器与移液管支架的管路
体视显微镜	卡尔·蔡司	Stemi 2000-C	用于观察针尖以及幼虫制备过程
直边剃须刀片	Canopus	从亚马逊网站购买	在制作解剖针时切割钨丝
注射器	Becton Dickinson 公司	309602	用细胞外溶液填充，用于注入记录电极
移液管	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	一次性非无菌移液管，用于转移幼虫
三卡因甲磺酸盐	辛德尔	12854	用于通过高剂量安乐死幼虫的药用麻醉剂。
钨丝	World Precision Instruments 公司	715500	0.002 英寸，50.8 μ微米直径；用于制作解剖针
真空过滤装置	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	一次性无菌真空过滤装置，用于电生理电极灌流液中细胞外溶液的无菌过滤
电压钳-电流钳前置放大器	Molecular Devices	CV-7B	配备用作左臂和右臂记录头段的 MultiClamp 700B 放大器
α-bungarotoxin	赛默飞世尔科技	B1601	用于在记录前固定幼虫