在固定斑马鱼幼体中监测传入神经元的电信号

摘要

来源：Lunsford, E. T.，等. 斑马鱼游泳过程中后侧线传入神经元的活动。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了通过将微吸管置于瘫痪斑马鱼幼虫的侧线神经节附近并形成松密封接来记录传入神经元电信号的方法。在此过程中，细胞外溶液可维持神经元的活性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 电生理记录所需材料的准备

1. 制备硅胶弹性体底部的记录培养皿。
   1. 将一层薄薄的自混合型硅胶弹性体组分（例如 Sylgard）滴加至底部为盖玻片的组织培养皿中，直至其液面与浅井边缘齐平。约 0.5 mL 即可。
   2. 盖上盖子，在室温下固化至少 48 小时。
2. 制备解剖针。
   1. 使用直流电源，将蚀刻液（3M KOH）盛于 100 mL 烧杯中并接负电极（5 V），将一根钨丝（直径 0.002 英寸；50.8 µm）连接至正电极输出端。
      ​警告：在该操作过程中，正负极导线不得相互接触，否则可能产生火花，存在引发火灾的潜在风险。
   2. 通过在蚀刻液中快速反复浸入钨丝尖端，使其逐渐变细至尖锐点状。在体视显微镜下，使用直边剃刀刀片从尖端起约 1 mm 处切断钨丝。重复此过程三次，然后使用精细镊子将针插入已固化的记录培养皿中。
3. 准备记录电极。
   1. 使用配备盒状灯丝的水平微电极拉制仪，将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（内径：0.86 mm，外径：1.50 mm）拉制成电极，使其尖端直径为 30 µm，并具有轻微锥度（图 1 Ai），用于记录后侧线传入神经元。
   2. 另取一根硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成一对尖端直径更小（1–5 µm）的电极。双手各持一个电极，轻轻使两尖端相互划过，使其断裂成约 30° 的斜角。使用微电极抛光仪将斜面尖端抛光至光滑。
4. 在电生理记录程序中生成实验方案。
   1. 确保正确的前置放大器已连接至微电极电流/电压钳放大器背面的通道 1 输入端，用于传入神经元记录。
      ​注意：电流/电压钳放大器所用计算机的最低配置要求为：处理器主频 1 GHz 或更高，Windows XP Pro 或 Mac OS X 10.46.6 操作系统，配备 CD-ROM 驱动器，512 MB 内存，500 MB 硬盘空间，以及 2 个 USB 接口。
   2. 打开计算机控制的放大器软件。
   3. 点击 IC 按钮，将通道 1 设置为电流钳模式。
   4. 在 I-Clamp 1 选项卡下输入以下参数：主输出：100x 交流膜电位（100,000 mV/mV），增益：1,000，贝塞尔滤波器：1 kHz，交流滤波：300 Hz，示波器：旁路。次级输出：100x 交流膜电位（100 mV/mV），增益：1，低通滤波器：10 Hz。
   5. 将该通道参数保存为 Ch1_Aff。
   6. 安装并打开膜片钳电生理软件。
   7. 点击“配置”并选择“实验台”，通过将 Ch1_Aff 添加到已连接至放大器对应通道 1 缩放输出端的 BNC 同轴电缆所连的采集卡通道（例如 Analog IN #0 和 Analog IN #1），来设置模拟信号。点击“确定”。
      ​注意：采集卡的最低计算机配置要求为：处理器主频 1 GHz 或更高，Windows XP Pro 或 Mac OS X 10.46.6 操作系统，CD-ROM 驱动器，512 MB 内存，500 MB 硬盘空间，以及 2 个 USB 接口。
   8. 点击“采集”并选择“新建方案”。
   9. 在“模式/速率”选项卡中，选择“连续记录”模式；在“采集模式”下，将“试验时长”设置为“使用可用磁盘空间”（即持续记录直至手动停止）或设定一个期望的持续时间（hh:mm:ss），然后将每信号的采样率（Hz）设为 20,000，以最大化分辨率。
   10. 在“输入”选项卡下，选择先前已配置的模拟输入通道（步骤 1.4.6 中设置），并为对应通道选择 Ch1_Aff。
   11. 在“输出”选项卡下，分别为通道 #0 和通道 #1 选择 Cmd 0 和 Cmd 1。
       1. 使用 BNC 同轴电缆将放大器上的通道 1 命令输出端连接至采集卡的模拟输出 0 端口。
   12. 其余选项卡可保持默认设置。点击“确定”并保存该方案。

2. 溶液配制

1. 配制 Hank's 溶液：137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na₂HPO₄、0.44 mM KH₂PO₄、1.3 mM CaCl₂、1.0 mM MgSO₄、4.2 mM NaHCO₄；pH 调至 7.3。用去离子水将原液稀释至 10% 的 Hank's 溶液。
2. 配制细胞外溶液：134 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.2 mM MgCl₂、2.1 mM CaCl₂、10 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES 缓冲液，用 NaOH 调节 pH 至 7.8。使用孔径为 0.22 µm 的滤膜对细胞外溶液进行真空过滤。
3. 配制 α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）：将 1 mg 冻干的 α-银环蛇毒素溶于 10 mL 细胞外溶液中，制成 0.1% 的稀释液。
4. 配制安乐死溶液：在 10% Hank's 溶液中配制含 50%（mg/L）缓冲的药用级 MS-222 溶液。
   注意：α-银环蛇毒素是一种强效神经毒素，可通过阻断胆碱能受体引起肌肉麻痹。操作此类麻痹性物质时必须佩戴手套，建议佩戴护目镜。

3. 电生理记录用幼虫的制备

1. 固定斑马鱼幼体。
   1. 使用实验室培育的斑马鱼（Danio rerio；受精后4-7天）幼体，并将其饲养于胚胎溶液（10% Hank's溶液）中，温度维持在27 °C。
   2. 使用大口径移液吸头将幼体从饲养容器转移至小培养皿（35 mm）中，并尽可能吸除周围的溶液。
      注意：去除胚胎溶液可防止麻痹剂被稀释，从而提高其效力。可用拭纸的角落吸除残留的胚胎溶液，操作中必须避免接触幼体或使其暴露于空气中。
   3. 将幼体浸入10 µL的0.1% α-银环蛇毒素中，约5分钟。
      注意：使幼体完全固定所需的时间因样本而异。良好的制备状态需持续监测稳定的快速血流以及运动反应的减弱。短暂过度暴露于麻痹剂可能导致制备整体健康状况缓慢下降，即使在充分清洗后亦然。最佳操作是在幼体尚未完全固定、但仍表现出轻微肌肉震颤时即进行清洗。
   4. 用细胞外溶液清洗麻痹后的幼体，并浸泡10分钟。
      注意：清洗过程可使幼体从轻微肌肉震颤过渡至完全麻痹。此外，α-银环蛇毒素是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）α9亚基的拮抗剂，而该亚基是本实验方案所观察的内源性反馈回路中的关键组分；然而，已有研究表明，在Xenopus和斑马鱼的毛细胞中，该效应在10分钟清洗后是可逆的。
2. 将鱼固定在记录用培养皿中。
   注意：制备斑马鱼幼体（4-7日龄）时无需使用麻醉剂（如MS-222、Tricaine），因其可能干扰动物健康。事实上，斑马鱼幼体在某些脊椎动物实验规程中可被豁免。
   1. 使用移液吸头将幼体从细胞外溶液中转移至底部为硅胶的记录用培养皿中，并将培养皿其余空间充满细胞外溶液。
   2. 在体视显微镜下，用尖头镊子轻轻将幼体置于硅胶垫中央上方，使其侧面向上，身体前部在左，后部在右。然后用尖头镊子夹取硅胶垫上的刻痕针，垂直于硅胶面，穿过幼体肛门正背侧的背索插入第一根针。第二根针插入尾部末端附近的背索，第三根针插入鳔背侧的背索（图1B）。
      注意：插入针时应准确对准背索宽度的中央，以避免压迫血流或损伤周围肌肉组织。背索位于后侧线神经的背侧，因此若固定得当，不会损伤侧线感觉神经元。插入时应在初次接触后立即进行，以避免扰动周围组织。理想情况下，针的直径应小于背索宽度的一半，以确保顺利插入。若针的直径超过此范围，则需重复步骤1.2，直至获得合适直径的针。若固定后血流减慢，应更换新样本并从步骤1.3开始重复操作。
   3. 插入第四根针时，穿过耳囊的同时轻微向头部方向旋转（图1B）。当施加轻微旋转时，注意观察肩胛骨与耳囊之间的组织，以暴露传入神经元胞体的簇状结构。
      ​注意：第四根针采用斜向插入，以确保暴露被较大的耳囊遮挡的后侧线传入神经节。

4. 传入神经元记录

1. 用30 µL细胞外液填充传入神经记录电极，将其插入右侧头部支架的移液管固定器中（图1B、C），并在施加由气动换能器产生的正压（1-2 mm Hg）的同时，将其缓慢下降至培养皿溶液中。
2. 定位并松散地附着于后侧线传入神经节。
   1. 使用显微操作器，将传入神经电极尖端缓慢下降，直至其位于锁骨上方并保持稳定位置。
   2. 将放大倍数提高至40倍浸没镜头，找到后侧线神经与锁骨的交汇处。从锁骨处沿侧线神经向前追踪，直至观察到神经纤维支配的后侧线传入神经节，该神经节可通过其明显的胞体聚集区进行识别（图1F）。
   3. 将电极尖端移至传入神经节上方，并缓慢下降移液管，直至尖端接触上皮层。轻柔地调整电极位置，使整个电极尖端边缘均与传入神经节接触。
   4. 使用气动换能器施加负压（20–50 mm Hg）并保持稳定。
      注意：施加于传入神经节的负压应轻柔。虽然增加负压可改善信噪比，但持续施加较强的负压会损害传入神经元的健康状态，从而降低成功记录的概率。
3. 记录传入神经元活动。
   1. 左侧头部支架应连接至放大器，后者将放大后的信号传递至数字化器，再由数字化器将信号输出至膜片钳电生理软件，以便在相邻的计算机上进行实时监测。
   2. 在pClamp10软件中，点击工具栏上的播放按钮以开始监测传入神经元活动。
   3. 当出现自发性动作电位，且放电频率约为每100–200 ms一次时，表明已成功实现传入神经元的全细胞松散贴附记录模式（图1E）。
   4. 逐步将传入神经元记录电极内的压力恢复至大气压（0 mm Hg），并在后续记录过程中保持该压力状态。

结果

图1：后侧线传入神经元与腹侧运动根活动的同时电生理记录。（A）松散贴附式传入神经（i）和腹侧运动根（ii）记录电极的示例。比例尺为50 µm。（B）将幼年斑马鱼麻痹后，用四个位置的针（交叉符号）固定于Sylgard培养皿中，以确保记录稳定性。加粗的交叉符号表示固定针的插入点。（C）电生理装置安装在防震台上，包含一台可进行40倍放大、由电机控制器调节的直立式固定载物台显微镜。双通道电流钳和电压钳前置放大器安装在微操纵器上。（D）体壁肌节由肌隔膜...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mL 烧杯	PYREX	1000	酸蚀剂容器
10倍水浸物镜	Olympus	UMPLFLN10xW	低倍镜用于定位幼虫和记录电极
40倍水浸物镜	奥林巴斯	LUMPLFLN40XW	高倍放大以定位电极尖端并建立膜片钳
BNC同轴电缆	ThorLabs	2249-C-12	连接放大器和数字化器通道；需要4个
带纤维丝的硼硅酸盐玻璃毛细管	Warner Instruments	G150F-3	内径：0.86，外径：1.50；用于制备记录电极的毛细玻璃管
计算机	N/A	N/A	任何计算机均可使用
直流电源	天马	72-420	用于电蚀刻解剖针
电生理学数字转换器	Axon Instruments，Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	可实现膜片钳数据的采集
丝状结构	Sutter Instrument Company	FB255B	微移液管拉制仪中使用的2.5 mm盒装灯丝
精细镊子	Fine Science Tools	Dumont #5（0.05 × 0.02 mm）货号 11295-10	用于操作幼虫并插入针具
固定载物台微分干涉相差显微镜	奥林巴斯	BX51WI	用于观察和建立膜片钳记录的显微镜
柔性锥形移液管吸头	Fisher Scientific	02-707-169	柔性尖端可插入记录电极，以便在尖端处释放细胞外溶液
FluoroDish	World Precision Instruments 公司	FD3510-100	盖玻片底部培养皿记录皿
KimWipe	KimTech	34155	用于吸除幼虫多余液体的擦拭任务
Kwik-Gard	World Precision Instruments 公司	710172	自混合Sylgard弹性体
微电极放大器	Axon Instruments，Molecular Devices	MultiClamp 700B	用于双通道记录的膜片钳放大器
显微操作仪	Narishige	MF-830 微型玻璃拉针仪	抛光记录电极
显微操作仪控制单元	锡斯基尤	MC1000-eR/T	用于控制显微操作仪的四轴旋钮控制器
微移液管拉制仪	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	用于将玻璃毛细管拉制成记录电极
显微镜控制单元	锡斯基尤	MC1000e	将显微镜置于固定载物台及其制备样品周围
电动显微操作器	锡斯基尤	MX7600	定位头架及相连的记录电极，用于膜片钳记录
MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2	可从 Axon MultiClamp 700B Commander 下载页面获取
光学气浮平台	Newport Corporation	VH3036W-OPT	面包板式隔振台，用于悬浮显微镜并减少记录过程中的振动
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	可从 Axon pCLAMP 10 膜片钳电生理数据采集系统下载 & 分析软件下载页面
培养皿	Falcon	35-3001	用于将幼虫浸入麻痹剂中
移液器架	Molecular Devices	1-HL-U	手持记录电极并连接至前置放大器
气动换能器	福禄克生物医学仪器	DPM1B	用于控制记录电极内部压力
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	221473-25G	用于蚀刻解剖针的蚀刻剂
硅胶管	Tygon	14-169-1A	连接气动换能器与移液管支架的管路
体视显微镜	卡尔·蔡司	Stemi 2000-C	用于观察针尖以及幼虫制备过程
直边剃须刀片	Canopus	从亚马逊网站购买	在制作解剖针时切割钨丝
注射器	Becton Dickinson 公司	309602	用细胞外溶液填充，用于注入记录电极
移液管	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	一次性非无菌移液管，用于转移幼虫
三卡因甲磺酸盐	辛德尔	12854	用于通过高剂量安乐死幼虫的药用麻醉剂。
钨丝	World Precision Instruments 公司	715500	0.002 英寸，50.8 μ微米直径；用于制作解剖针
真空过滤装置	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	一次性无菌真空过滤装置，用于电生理电极灌流液中细胞外溶液的无菌过滤
电压钳-电流钳前置放大器	Molecular Devices	CV-7B	配备用作左臂和右臂记录头段的 MultiClamp 700B 放大器
α-bungarotoxin	赛默飞世尔科技	B1601	用于在记录前固定幼虫