冠状海马脑片中诱发电位钾离子浓度动态的测量

摘要

来源：Octeau, J. C. 等. 在成年脑组织切片中制备、测试和使用钾离子选择性微电极。J. Vis. Exp. (2018)。

该视频展示了对小鼠冠状海马脑片进行电刺激后诱发的钾离子浓度动态变化。将双极刺激电极插入海马CA3区的辐射层，同时将钾离子选择性电极置于CA1区的辐射层。电刺激引发动作电位，导致钾离子释放。最后，在存在抑制性分子的情况下，诱发的钾离子反应消失，证实了钾离子浓度的动态变化源于Schaffer侧支中的动作电位产生。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 急性海马脑片的制备

1. 切片溶液的制备
   1. 配制500 mL蔗糖切割液，成分为：194 mM 蔗糖、30 mM NaCl、4.5 mM KCl、10 mM D-葡萄糖、1 mM MgCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄ 和 26 mM NaHCO₃，渗透压为290–300 mOsm，用95% O₂ 和5% CO₂饱和。
   2. 配制1–2升记录液（人工脑脊液，ACSF），成分为：124 mM NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM D-葡萄糖、2 mM CaCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄ 和 26 mM NaHCO₃；pH值为7.3–7.4（通气后），渗透压为290–300 mOsm，用95% O₂ 和5% CO₂饱和。将装有脑片保存室的烧杯中加入记录液，并维持在32–34 °C。将振动切片机腔室中加入冰水混合物。
2. 急性脑片制备
   1. 将小鼠置于预先充有2–3 mL异氟烷的密闭容器中，进行深度麻醉。检查趾夹反射，若无反应，则根据动物实验方案要求，使用锋利的剪刀或断头器迅速将其断头。
   2. 使用剪刀从颅骨尾侧开始，沿中线剪开头皮，形成2–3 cm的切口。手动牵拉头皮的同时，从枕骨大孔处沿颅骨两侧各做一条长约1 cm的横向切口。然后使用精细剪刀，从颅骨后部至鼻部沿中线剪开整个颅骨长度的切口。
   3. 将精细镊子插入靠近中线的位置，将切开的颅骨向两侧分开。取出小鼠脑组织，并用刀片切除位于脑尾侧和头侧的小脑和嗅球。这些结构可通过其与大脑皮层之间明显的深沟进行识别。
   4. 使用速干胶将脑组织块固定在振动切片机的载物盘上。向振动切片机的托盘中加入冰冷的切割液。
   5. 在冠状面上切割厚度为300 µm的组织切片。通常可收集到6个冠状海马切片。
   6. 每切完一片后，立即将切片转移至预热至32–34°C的切片保存烧杯中。在此温度下孵育20分钟，随后将烧杯移至室温环境中，继续静置至少20–30分钟，再进行记录实验。

2. 电刺激诱发的K⁺ 动态变化的测量

1. 切片制备的设置
   1. 使用巴斯德移液管轻轻将脑切片放入浴槽中，并用带有尼龙丝的铂金弓形固定器轻轻固定切片位置。
   2. 确保双极刺激电极的尖端相互平行，并与切片平面齐平。在约6-7秒的时间内缓慢将电极插入CA3区辐射层，深度约为40-50 µm，以刺激Schaffer侧支。在冠状切面中，CA3区大致可识别为海马角处颗粒细胞层外侧的海马本体部分，而辐射层位于锥体细胞层的内侧和腹侧。
   3. 通过在约3-4秒内缓慢降低电极，将K⁺-选择性电极小心插入CA1区辐射层，深度约为50 µm。在对切片施加刺激前，需等待电极电位稳定：通常需要5至10分钟。如果切片表现出细胞外K⁺ 的自发性变化，则弃用该切片，并使用新的切片重复此过程。
2. 测量诱发的K⁺ 释放
   1. 通过手动按压刺激器上的触发按钮施加电刺激串（8个脉冲），同时进行反应的数字记录。刺激参数设置为10 Hz频率、1 ms脉宽，起始刺激强度为10 µA。
   2. 以2倍递增的方式逐步提高刺激强度，直至检测到最大K⁺ 反应幅度。若未观察到任何反应，可将K⁺ 电极向刺激部位方向移动，每次移动100 µm，逐步调整位置。
   3. 确定产生半最大反应的刺激强度。根据我们的经验，该值通常在40-160 µA之间，具体取决于切片质量、动物年龄以及刺激电极与K⁺ 选择性电极之间的距离。
   4. 在同一切片中，使用比产生半最大反应低一个递增步长的刺激强度（例如，若80 µA产生半最大反应，则使用40 µA），施加脉冲数逐步增加的刺激串。我们最初采用的刺激串包含1、2、4、8、16、32、64和128 个脉冲。
   5. 为确认K⁺ 信号是由电刺激Schaffer侧支引发的动作电位所介导的，可在人工脑脊液（ACSF）中加入0.5 µM河豚毒素（TTX），孵育10分钟，然后重复刺激方案。此时不应观察到任何诱发反应。
   6. 完成切片实验后，通过在标准校准液中重新校准电极，确认电极响应性能是否保持稳定，并确保其响应值与初始校准值的偏差不超过10%。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
振动切片机	DSK	Microslicer Zero 1
小鼠：C57BL/6NTac 近交系小鼠	Taconic	Stock#B6
显微镜	Olympus	BX51
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
定制微管 28G 尖端	World precision instruments	CMF28G
钨棒	A-M Systems	716000
双极刺激电极	FHC	MX21XEW(T01)
刺激隔离器	World precision instruments	A365
Grass S88 刺激器	Grass Instruments Company	S88
硼硅酸盐玻璃移液管	World precision instruments	1B150-4
A/D 板	Digidata 1322A	Axon Instruments
信号放大器	Multiclamp 700A 或 700B	Axon Instruments
前置放大器	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
膜片钳计算机	Dell	n/a
氯化钠	Sigma	S5886
氯化钾	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
碳酸氢钠	Sigma	S5761
磷酸二氢钠	Sigma	S0751
D-葡萄糖	Sigma	G7528
氯化钙	Sigma	21108
氯化镁	Sigma	M8266
缬氨霉素	Sigma	V0627-10mg
1,2-二甲基-3-硝基苯	Sigma	40870-25ml
四(4-氯苯基)硼酸钾	Sigma	60591-100mg
5% 二甲基二氯硅烷庚烷溶液	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
盐酸	Sigma	H1758-500mL
蔗糖	Sigma	S9378-5kg
移液管显微操作器	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
物镜	Olympus	PlanAPO 10xW