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所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。
注意：可对Q175野生型（WT）和杂合子（HETs）在任何年龄和性别进行记录。本研究中，我们对51至76周龄的雄性和雌性个体进行了研究。
1. 将谷氨酸传感器 iGluu 注射至皮质-纹状体轴突以实现其表达
- 使用拉针仪（一步拉制模式）制备用于病毒注射的硼硅酸盐玻璃毛细管。拉制完成后，手动折断毛细管，使其尖端直径达到 30–50 µm。对毛细管及手术器械（包括用于开颅的钻头）进行高压灭菌处理。
- 将病毒 AAV9-CaMKIIa.iGluu.WPRE-hGH（7.5 × 1013 gc/mL）以 10 µL 分装液的形式储存于 -80 °C。若在病毒制备后不久（6 个月内）进行注射，则可暂时保存于 5 °C。手术前取出病毒管，置于室温下平衡。
- 用病毒溶液填充玻璃毛细管，并去除其中所有气泡。
- 通过腹腔注射含有 87.5 mg/kg 氯胺酮和 12.5 mg/kg 赛拉嗪的溶液来麻醉动物。皮下注射 0.25% 布比卡因（8 mg/kg）以提供额外镇痛。通过监测肌肉张力并观察疼痛诱发反射是否消失来评估麻醉深度。
- 剃除头部皮肤毛发，并用 70% 酒精消毒。将小鼠固定于立体定位仪中。
- 使用手术刀去除皮肤，再用高速（38,000 rpm）钻头在运动皮层上方颅骨处钻出一个直径为 1.2 mm 的孔。
- 将连接注射毛细管的注射器安装至精密操纵器的夹持装置上。将垂直取向的毛细管插入皮层四个不同位点。注射位点坐标相对于前囟（单位：mm）为：前囟前 1.5，外侧 1.56、1.8、2.04、2.28；相对于硬脑膜的深度（单位：mm）为：1.5–1.7。
- 使用注射系统，以 0.05 µL/min 的速度在每个位点注射 0.3 µL 未稀释的病毒溶液。每次注射后，将毛细管留置原位 1 分钟，然后以 1 mm/min 的速度缓慢撤出。
- 使用尼龙缝线缝合手术切口，完成手术。
- 术后将小鼠置于清洁笼盒内的加热垫上恢复 0.5 至 1 小时，之后放回原笼盒。
- 在制备急性脑切片前，维持小鼠于 12 小时昼夜循环条件下饲养 6 至 8 周。
注意：为避免因免疫反应导致细胞损伤和突触丢失，若需注射多种病毒载体，必须同时进行，或在初次注射后 2–3 小时内完成。iGluu 的注射坐标依据 Paxinos 与 Franklin 脑图谱选定，对应 M1 运动皮层。对注射后脑组织进行免疫染色，可在同侧及对侧纹状体以及对侧 M1 和 S1 皮层中观察到大量但多数相互分离的轴突及其轴突曲张体。
2. 搜索表达谷氨酸传感器 iGluu 的谷氨酸能终末
- 校准模式
- 使用以下设置准备sCMOS相机及相机控制软件。在读出页面中，设置像素读出速率：560 MHz（= 最快读出速度），灵敏度/动态范围：bit，杂散噪声滤波器：是，重叠读出：是。在 binning/ROI页面中，选择全屏。
- 准备一张载玻片，其上含有滴加的5 mg/mL 荧光黄（Lucifer Yellow, LY），并加盖盖玻片。
- 将LY载玻片置于63倍物镜下，打开激光快门，并使用以下设置进行连续成像：像素binning：1×1，触发模式：内部触发，曝光时间：最小值（待确定）。
- 调节激光功率，使荧光斑点直径为4 µm（图像中不应包含饱和像素）。
- 为校准激光定位系统，在激光定位软件中选择以下设置：光斑直径：10，扫描速度：43.200 kHz。点击右侧面板上的开始图像采集按钮。在序列页面中设置运行次数：0，运行延迟：0，并选择TTL触发运行选项。点击校准按钮，并根据采集屏幕左上角显示的说明校准激光控制软件。
- 如果系统使用独立的相机与激光控制软件，则从相机采集窗口截取屏幕截图，并将其发送至激光控制软件以重新计算XY坐标。若软件安装在不同计算机上，则使用视频采集器将图像导入激光控制软件。激光控制软件需要XY缩放因子和偏移量信息。为此，确定激光控制程序采集窗口内图像的左上角、左下角和右下角坐标。根据以下公式计算缩放因子：X因子 = (X右下角 – X左下角)/2048，X偏移量 = X左下角，Y因子 = (Y左上角 – Y左下角)/2048，Y偏移量 = Y左下角。
- 校准程序结束后，创建一个267×460像素的矩形感兴趣区域（ROI），将其移至屏幕中央，然后点击开始序列按钮。
- 恢复以下相机控制软件设置：binning：2×2，触发模式：外部曝光触发，曝光时间：最小值（待确定）。
- 自发荧光校正模式
注意：在活跃突触末梢周围环境中，谷氨酸（[Glu]）的静息浓度通常低于100 nM。因此，在没有突触谷氨酸释放的情况下，任何谷氨酸传感器（尤其是低亲和力传感器如iGluu）的荧光信号都较弱。尽管如此，即使在静息状态下仍可检测到部分iGluu荧光，但必须将其与组织自发荧光区分开来。473 nm激发光会同时激发iGluu荧光和自发荧光（图1A–C）。后者覆盖较宽波长范围，而iGluu荧光则局限于480–580 nm（峰值在510 nm）。自发荧光校正基于使用不同高通滤光片采集两幅图像。
- 按其他部分所述方法预先制备脑片。保持脑片处于可用状态。
- 将脑片转移至记录浴槽中，浸没于含氧人工脑脊液（ACSF）中，其成分为：125 mM 氯化钠（NaCl），3 mM 氯化钾（KCl），1.25 mM 磷酸二氢钠（NaH2PO4），25 mM 碳酸氢钠（NaHCO3），2 mM 氯化钙（CaCl2），1 mM 氯化镁（MgCl2），10 mM 葡萄糖（pH 7.3，303 mOsm/L），并补充0.5 mM 丙酮酸钠、2.8 mM 抗坏血酸钠和0.005 mM 谷胱甘肽。灌流速率为1–2 mL/min。维持浴槽温度在28–30 °C。
- 在20倍水浸物镜下定位背侧纹状体。使用尼龙网格固定在铂金丝网上，以最小化组织移动。切换至63倍/NA 1.0水浸物镜。选择反射473 nm光的滤光片（二向色镜）和透过波长>510 nm的发射滤光片。
- 使用模数/数模（AD/DA）转换板及其配套控制软件，同步照明、刺激和图像采集。设置触发程序，控制激光曝光时间为180 ms，图像采集时间为160 ms。使用激光定位装置将激光束引导至预设数量的点位，并设定扫描速度和光斑大小参数。
- 使用510 nm高通滤光片采集同时包含自发荧光和iGluu阳性结构的图像（“黄光图像”）。
- 使用600 nm高通滤光片采集仅含自发荧光的图像（“红光图像”）。
- 利用最亮10个像素和最暗10个像素的平均强度定义范围，对红光和黄光图像进行缩放。执行“黄光减红光图像”的减法运算，并对相减后的图像重新缩放，生成标准8位tif文件，以便清晰显示目标突触小结（图1D）。该图像包含来自iGluu阳性结构的亮像素、背景的灰色像素以及具有自发荧光结构的暗像素。
注意：使用给定设备时，平均静息荧光强度（F）将低于700 A.U.
- 突触小结搜索模式
注意：iGluu阳性像素可能属于轴突树中功能不同的结构，例如不同等级的轴突分支、分叉位点、囊泡耗竭后的膨大结构或完全活跃的膨大结构。然而，仅通过肉眼观察几乎无法识别功能性突触末梢。因此，每个谷氨酸能突触末梢必须通过其对电去极化的响应性来确认。对刺激无反应的位点应予以剔除。诱导皮质-纹状体轴突谷氨酸释放的生理方法是引发动作电位。这可通过使用具有适当光谱特性的通道视紫红质，或通过电刺激被iGluu本身标记的轴突来实现。为避免意外激活视蛋白，我们更倾向于后者
- 使用微电极拉制仪（四步模式）从硼硅酸盐玻璃毛细管拉制刺激电极。内尖端直径应约为1 µm。当充满ACSF时，电极电阻应约为10 MΩ。
- 为诱导附着于同一轴突上的一组突触小结发生动作电位依赖性谷氨酸释放，使用63倍放大倍数、510 nm发射滤光片及相减后的图像，将玻璃刺激电极放置在荧光膨大结构附近。避免靠近其他额外的轴突。
- 开启刺激器，向刺激电极输送去极化电流脉冲。使用约2 µA的电流强度（不超过10 µA）。
- 启动多通道浴槽给药系统，其中一个通道输送标准灌流液，其他通道输送必要的离子通道、转运体或膜受体阻断剂。控制记录位置的流速，然后切换至河豚毒素（TTX）通道（灌流液加1 µM TTX）。2–3分钟后，再次刺激目标突触小结，但此时无动作电位产生。此时的释放直接由电压门控钙通道介导的钙内流引起。
- 通过调节刺激器上的强度旋钮，调整刺激电流，使响应与动作电位引发的响应相似。通常，对于0.5 ms的去极化，刺激电流约为6 µA。
- 为基本测试制备效果，应用0.5 mM CdCl2。该钙通道阻断剂可完全抑制突触谷氨酸释放，从而验证直接诱发的谷氨酸信号具有钙依赖性。
注意：以下一般性建议有助于提高在纹状体中进行单突触实验的成功率。为选择具有完整释放机制的谷氨酸能突触末梢，膨大结构应满足：(i) 具有平滑的纺锤形形态；(ii) 不位于轴突分叉处；(iii) 在“黄光图像”中比其他结构更亮；(iv) 位于纹状体神经毡内而非纤维束中；(v) 位于非常细的轴突分支上；(vi) 不位于脑片较深层区域。
3. 谷氨酸释放与清除的可视化
- 记录模式
注意：在减去自体荧光（步骤 2.2）并对目标突触小结进行初步反应性测试（步骤 2.3）后，即可开始数据采集。单个轴突末梢释放谷氨酸所引发的反应可直接在图像中观察到（图 2），无需进一步分析工具。然而，立即提取一些突触功能的基本指标已被证明非常方便（图 3）。这些信息对于决定后续实验流程至关重要，例如特定末梢类型的筛选、亨廷顿病（HD）相关改变的快速评估、试验次数与频率，或通过灌流系统施加药物的方案。此外，可能还需要处理实验过程中出现的伪迹。首先，描述数据记录的标准设置。
- 使用显微镜的 XY 驱动装置，将待测的 iGluu 阳性突触小结移至视野中心附近。点击中止采集按钮停止图像采集。在最后一帧图像上，用鼠标左键点击静息状态下突触小结的中心，以确定其 XY 位置。所设光标的 XY 坐标将显示在采集窗口底部的状态栏中。
- 利用校准数据（步骤 2.1.6），计算激光束应照射的位置坐标，以激发 iGluu 荧光。使用以下公式：X 激光 = X 相机 × X 因子 + X 偏移，Y 激光 = Y 偏移 – Y 相机 × Y 因子。在进行此重新计算时，需注意相机的垂直或水平翻转设置。
- 在激光控制软件中，使用计算出的坐标创建一个单点序列。具体操作为：在激光控制软件的序列页面中，于添加到序列框内选择点。设置延迟触发时间为 10 µs，激光脉冲时间为 180 ms。将鼠标移至计算出的坐标位置，点击左键。
- 在激光控制软件中选择以下设置：运行次数：0，运行延迟：0，序列：TTL 触发运行。然后点击启动序列。
- 在相机控制软件中选择以下设置：在 binning/ROI 页面，设置图像区域：自定义，像素合并：2x2，高度：20，宽度：20，左边界：静息 iGluu 阳性区域 X 坐标减去 10 像素，底边：静息 iGluu 阳性区域 Y 坐标减去 10 像素，采集模式：动力学序列，动力学序列长度：400，曝光时间：0.0003744 s（最小值）。采用这些设置，采集速率为 2.48 kHz。
- 选择触发模式：外部触发。在相机控制软件中点击获取信号，并启动为触发设备设定的实验方案。
- 执行实验方案试验，时间线如下：0 ms – 开始试验，1 ms – 启动激光照射，20 ms – 启动相机图像采集，70 ms – 启动第一次电刺激，120 ms – 启动第二次电刺激，181 ms – 结束试验（激光与相机关闭）。因此，在一次试验中，相机以 2.48 kHz 的频率采集 400 帧图像。有关电刺激的详细信息，请参见步骤 2.3.3 和 2.3.5。
- 为确保突触前囊泡池有足够恢复时间，应以 0.1 Hz 或更低的重复频率执行试验方案。
- 离线构建谷氨酸瞬变信号，并快速评估谷氨酸释放与清除，以识别病理性突触
- 启动评估程序。此处我们使用自行开发的软件 SynBout v. 3.2（作者：Anton Dvorzhak）。以下步骤用于从 iGluu 荧光增强的像素中构建 ΔF/F 瞬变信号，如图 2 视频所示。
- 为确定突触小结大小，计算静息状态下感兴趣区域（ROI）荧光强度的均值和标准差（SD，记为 F），即在刺激开始前的荧光值。确定并框选荧光强度 F>均值 + 3 SD 的像素区域（图 3A）。假设该超阈值区域呈圆形，计算其虚拟直径（单位：µm）。
- 将 ΔF 定义为峰值强度值与 F 之间的差值。绘制刺激电流和 ΔF/F 随时间变化的曲线（图 3B）。计算刺激前静息状态下 ΔF/F 的标准差（SD），并计算“峰值幅度”。选取 ΔF/F 峰值幅度超过静息状态 3 倍 SD 的像素，进行单指数拟合以分析其从峰值开始的衰减过程，并确定 ΔF/F 衰减的时间常数 TauD。
- 为估算特定突触的“最大幅度”，选择 ΔF/F 值最高的像素。该像素通常位于静息状态下 iGluu 荧光突触小结的内部或边界附近。“最大幅度”是反映单个突触清除机制所承受谷氨酸负荷的最佳指标。
