在大鼠多个脑区进行体内电生理记录脑活动

摘要

来源：Haumesser, J. K.，等。在麻醉大鼠中对超直接通路的局部场电位和多单位活动进行急性体内电生理记录。J. Vis. Exp.(2017)。

本视频展示了在多个位点进行脑电活动电生理记录前，制备麻醉大鼠的详细步骤。通过解剖头皮暴露颅骨，并在精确位置钻孔以安装和固定电极。随后将钨丝微电极插入目标位置，以记录数据。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 手术

1. 进行电生理记录时，使用乌拉坦（CAUTION）进行麻醉。
   注意：乌拉坦具有毒性和致癌性，因此务必遵守该物质制造商提供的安全规程和数据表中的规定。
2. 配制浓度为 200 mg/mL 的乌拉坦溶液，溶剂为 0.9% 氯化钠（NaCl）生理盐水。
3. 按 1.3 g/kg 体重剂量经腹腔（IP）注射乌拉坦。根据大鼠品系的不同，为提高麻醉安全性，可将总剂量分为两次注射，两次注射间隔 15 分钟。
4. 通过足底回缩反射及其他适当反射评估麻醉深度。若麻醉深度不足以进行手术操作，可追加注射 0.15 g/kg 体重剂量的乌拉坦（IP），并等待 15 分钟。
5. 涂抹眼膏以防止角膜脱水。
6. 在麻醉期间持续监测呼吸频率和足底回缩反射。使用带温度控制的小动物加热垫，以确保手术全程维持生理体温。在开始电生理记录前，更换为非电传导的替代材料（例如醋酸钠头部垫片）。
7. 剃除头背部的毛发，以获得清洁的手术区域。使用适当的外科消毒剂对切口周围进行消毒。将动物固定于立体定位仪中。
8. 使用手术刀沿矢状方向做一条长约 2 cm 的头皮切口。用手术刀轻轻刮除颅骨腱膜，并对颅骨进行消毒。使用浸有 3% 过氧化氢（H₂O₂）的棉签清除残留组织。
9. 必要时使用电灼器或热灼器控制出血。若颅骨或皮下组织出血在 1–2 分钟内未自行停止，并影响对颅骨的视野，则应止血。
10. 调整门齿杆，使头部处于平颅位，即以颅骨上的前囟（bregma）和后囟（lambda）作为立体定位参考点时，二者位于同一水平面。这是实现高精度手术操作的关键步骤。使用标准的大鼠立体定位对准工具，在显微镜下将工具的标定尖端校准至前囟位置，并调节门齿杆，直至工具上对应前囟和后囟的标记点同时接触颅骨表面。
    注意：从一侧观察，并用另一侧的聚焦光源照射，有助于判断是否达到该条件。或者，使用带有细套管的立体定位夹持器，在显微镜下测量前囟和后囟的背腹向坐标，调节门齿杆直至前囟与后囟的背腹向坐标一致。
11. 使用带有套管的立体定位夹持器，以前囟为基准进行校准，然后计算颅骨上所有钻孔的位置。利用立体定位夹持器，通过轻划颅骨表面或使用外科标记笔，在颅骨上标记出待钻孔的位置。具体坐标取决于目标脑区；以 bregma 为参考的坐标在表 1中列出，包括小脑参考电极的建议坐标。
12. 使用微型钻头小心钻出所有孔洞。对于丘脑底核（STN）和黑质网状部（SNr），钻一个共用孔（尺寸约为 2 mm × 3 mm）。其余各钻孔直径应约为 1 mm。
13. 取两根细套管（至少 27 G），利用硬质表面或镊子将其尖端弯成钩状。使用这些钩状套管清除钻孔中的碎屑，并小心剪开并移除共用 STN/SNr 孔处的硬脑膜。
14. 用生理盐水冲洗钻孔区域。每隔 15 分钟向钻孔滴加一滴生理盐水，以防止脑组织和硬脑膜干燥。
15. 取微型钻头及匹配的不锈钢微型螺钉（例如 M 1.2 mm × 2 mm 螺钉），在小脑上方参考硬膜外电极孔之间钻孔并旋入微型螺钉；对 M1 区硬膜外电极位置进行相同操作。
16. 将自制的 Ag/AgCl 硬膜外电极滑入参考电极和 M1 电极的钻孔中。使用精细镊子引导电极尖端，将其直接置于颅骨下方并滑入钻孔内。
17. 使用双组分牙科丙烯酸树脂固定所有硬膜外电极。注意不要覆盖前囟点，也不要影响共用的 STN/SNr 孔。
18. 将装有钨丝微电极的预制夹持器插入立体定位仪中。
19. 将最腹侧的电极（用于靶向 STN）以前囟为基准进行校准。调整至共用 STN/SNr 孔上方的预定位置，并在显微镜视野下将电极缓慢下降至脑组织内。确保钨丝微电极平滑进入脑组织。

2. 电生理定位与记录

注意： 此步骤需要使用法拉第笼以及具备在线滤波和在线峰电位分离功能的多通道电生理记录系统。建议选用配备靠近动物头部的前置放大器的系统，以将电噪声和伪迹降至最低。除钨丝微电极外，还需至少一个硬膜外电极和一个参考电极，以记录超直接通路。建议成对植入硬膜外电极和参考电极，且彼此不接触，这有助于在电极故障时进行排查，并允许在数据分析中采用不同类型的参考方式。

1. 将可移动的法拉第笼放置在立体定位仪上方。如果仅有固定的法拉第笼，则需小心地将立体定位仪移入法拉第笼内，同时确保在立体定位仪到达最终位置之前，深部脑电极不得插入脑组织中。
2. 将电极连接至电生理记录系统的前置放大器（headstage）。确保参考电极已连接至相应的参考通道。
3. 设置记录软件：对原始信号进行带通滤波（0.05–8,000 Hz）并放大（增益 1,500–2,000 倍）。使用在线局部场电位（LFP）和动作电位（spike）滤波器，并设置适当参数（LFP 采用 0.05–250 Hz 带通滤波，多单元活动 MUA 采用 300–8,000 Hz 带通滤波）。所有滤波器均使用巴特沃斯型（butterworth-type）滤波器。
4. 如适用，设置在线动作电位分选的阈值。大多数记录软件允许设定动作电位阈值，即当信号幅度超过该值时，软件将其标记为一个动作电位。该阈值可通过数学方法确定，例如取滤波后动作电位信号平均幅度的若干倍标准差；但更推荐通过目视检查时长小于<500 ms 的数据片段，在图形用户界面中设定一条高于信号噪声水平的阈值线。
   注意：设置动作电位阈值的目的是统计动作电位数量并进行单元分选，以提供当前记录到多少神经元及其动作电位波形特征的信息。
5. 缓慢将钨丝微电极下降至目标区域背侧 1 mm 处，目标区域为超直接通路相关的丘脑底核（STN）。如有必要，等待信号稳定。
6. 进行电生理定位时，以 100 µm 为步长将电极向腹侧推进。每一步均评估放电模式、放电频率及动作电位波形，并与图 1中提供的典型示例进行比较。通常，致密核团在多个背腹向步骤中表现出快速且持续的放电，而富含纤维的结构则在后续腹侧步骤中表现出较低的放电率和较不均一的动作电位活动。
7. 对于超直接通路记录，需确保最腹侧的电极位于 STN 内。
   注意：当在未定带（Zona incerta）腹侧检测到多单元活动（MUA）显著增加时，表明已到达 STN。在 STN 腹侧，放电几乎完全消失，因为电极已进入内囊。当最腹侧电极位于 STN 时，钨微电极的构型可确保后方的第二根电极位于黑质网状部（SNr）。可能需要以微小步长进行背腹向精细调节，以便同时记录到 STN 和 SNr 典型的多单元活动。需注意，MUA 的频率取决于实际记录到的神经元数量以及脑激活水平。
8. 当电极到达目标结构后，设置在线滤波和动作电位分选（见图 2），然后开始数据记录。在局部场电位（LFP）记录中可识别出的不同皮层同步状态的典型示例如图 3所示。

表1：记录超直接皮质-基底神经节通路的立体定位坐标。 所有坐标点均以颅骨前囟为参考点，单位为毫米（mm）；n.a. - 不适用。

前-后向（从前囟起）	STN	SNr	M1	参考文献1	参考文献2
前-后向	-3.6	-4.8	+3.0	-10.0	-10.0
内-外向	+2.5	+2.5	+3.0	+3.0	-3.0
背-腹向	-8.0	n. a.	n. a.	n. a.	n. a.

结果

图1：靶向丘脑底核的背腹向电极轨迹记录到的典型多单位放电活动。 （A）腹侧后内侧丘脑核（VPM）、未定带（ZI）、丘脑底核（STN）和黑质网状部（SNr）的多单位记录。VPM 表现出稀疏且不规则分布的高幅尖峰放电，当电极接近 ZI 时，这种放电模式停止。当电极进入 STN 时，可观察到典型的高频放电模式，表现为中等幅度的短暂簇状放电。SNr 可通过其高幅且规律的放电模式加以识别。（B）STN 轨迹叠加于大鼠立体定位图谱图像21。上部分：冠状面；下部分：矢状面。注意电极尖端穿过 VPM 和 ZI 的路径。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定制硬膜外 Ag/AgCl 电极	Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com	产品编号 AG005127，99.99% 银丝	Ag/AgCl 电极可提供更优的信号质量，但仅可用于急性实验。可能的替代品：不锈钢电极
带丙烯酸块的立体定位固定装置	David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA	产品编号 型号 1770 标准电极固定器	确保丙烯酸块具有适合目标区域电极配置的凹槽。可通过锉刀轻松修改丙烯酸块以获得所需构型。可能的替代品：自制电极固定器
阻抗为 1.5 MΩ 的钨微丝电极	Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA	产品编号 WE3ST31.5A5-250um	1.5 MΩ 的阻抗对于同时记录多单元活动（MUA）和局部场电位（LFP）是必需的。可能的替代品：可使用不同材料的微电极。电极必须笔直、坚固且尽可能细。
大鼠定位工具	David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA	产品编号 型号 944 大鼠定位工具	可实现脑组织的精确定向，以匹配立体定位图谱。可能的替代品：带套管的立体定位固定装置
双组分牙科丙烯酸树脂	Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom	Simplex Rapid Powder Clear 225g，产品编号：ACR803；Simplex Rapid Liquid 150ml，产品编号：ACR920	根据所用电极的不同，若电极体积小且重量轻，使用快干胶可能是一种简便的替代方案。可能的替代品：快干胶（氰基丙烯酸酯类）
法拉第笼	自制		合适的法拉第笼是对电磁干扰最佳的防护措施，但任何可形成箱形结构或覆盖在框架上且由导电材料制成的物体均可能提供一定帮助。可能的替代品：铝箔或铜网
具备记录软件及在线 spike 分类功能的电生理记录系统	OmniPlex® 神经数据采集系统 Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA		离线分类软件是潜在替代方案，开源社区中可免费获取多种脚本和软件。