使用电压敏感染料染色的脑片中神经元活动的光学记录

摘要

来源：Tominaga, Y., 等. 利用电压敏感性染料在脑片中进行全场单光子光学记录. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种通过使用电压敏感染料染色的脑片来观察神经元活动变化的方法。该染料通过改变其荧光强度来反映神经元膜电位的变化。通过施加电刺激并结合先进的成像技术，该方法能够基于电压敏感染料的荧光信号实现对神经元膜电位实时变化的可视化追踪。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 实验仪器的每日准备

1. 打开放大器、计算机和相机系统，并检查软件是否正常运行。
2. 将人工脑脊液（ACSF）放入50 mL离心管中，并用碳氧混合气体（carbogen）充气。
3. 使用蠕动泵循环ACSF，调节流速至约1 mL/min。
4. 调节抽吸移液管的高度，使实验腔室内的液面始终保持恒定。
   注意：溶液液面高度对于获得稳定的记录至关重要，因此应使用显微操作器进行调节。
5. 将由黄色芯片制成、内含3 M KCl琼脂（2%）的接地电极安装到带有银-氯化银（Ag-AgCl）导线并滴加少量3 M KCl溶液的电极架中。
6. 使用锥形细管黄色吸头，向玻璃电极（外径1 mm，内径0.78 mm，用微电极拉制仪拉制而成）中加入少量ACSF（约为电极体积的三分之二），然后将其放入电极架中。
7. 将电极架固定在安装于操纵器上的金属杆上。通过放大器检测，确保电极电阻约为1 MΩ。
   注意：长柄、大开口（4–8 µm开口）的膜片钳电极适用于场电位记录和作为刺激电极。

2. 开始记录实验

1. 用镊子从湿润室中取出切片样本。
2. 迅速将切片置于显微镜下的实验腔室中 （图1）。
3. 将环的边缘牢固地压入硅胶O型圈中。注意不要损坏膜或实验腔室的底部。
   注意： 应考虑切片的方向与视野中刺激电极和记录电极方向的对应关系。健康的切片应能自然贴附于膜滤器上，因此无需使用其他固定装置（如重物或尼龙网）来固定切片。
4. 在透射光下，通过显微镜将刺激电极和场电位记录电极的尖端放置于切片上。
5. 使用电生理记录系统检查反应。确认在给定配置下获得正常的（未染色）电生理记录。
   注意： 记录电极可省略，但有助于检测切片的生理状态。
6. 调整激发光强度至相机最大容量的约70–80%，当以10 kHz采样频率、5倍水浸物镜和1倍PLAN APO管镜进行观察时，样品处的光强对应为13–15 mW/cm²。激发光波长为530 nm，发射滤光片必须 > 590 nm。
   注意： 使用快门以减少激发光照射量。持续光照可能损害切片的生理活性。光的潜在有害效应取决于其强度和照射时间。可通过电生理记录评估光照的影响。在13–15 mW/cm²强度下，约1秒的照射时间应为耐受上限。
7. 使用荧光光源并通过采集系统调整焦距，因为不同波长下的焦平面可能不同，随后开始图像采集。
8. 在图像采集软件中检查数据。
   注意： 我们使用数值分析软件的原始微编程包进行详细分析。

结果

图 1. 用于记录脑片制备中光学信号的系统。(A) 本研究中用于成像脑片的显微镜照片。光学系统包括物镜（5倍，数值孔径0.60）、用于二向色滤光片（580 nm）的镜盒，以及投影（管）镜头（PLAN APO ×1.0）。通过C型接口将高速相机连接在投影镜头顶部。另有一个常规USB相机用于观察。激发光通过光纤导入。(B) 与镜盒兼容的透镜照片。(C) 记录系统的示意图。成像系统和电生理记录系统均由一台计算机控制。光源采用带有光电二极管反馈控制系统的LED照明系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高速图像采集系统	Brainvision co. Ltd.	MiCAM - Ultima	成像系统
高速图像采集系统	Brainvision co. Ltd.	MiCAM 02	成像系统
用于宽场成像的宏成像系统	Brainvision co. Ltd.	THT macroscope	宏成像系统
带光电二极管稳定器的高功率LED照明系统	Brainvision co. Ltd.	LEX-2G	LED照明
图像采集软件	Brainvision co. Ltd.	BV-ana	图像采集软件
多功能电刺激器	Brainvision co. Ltd.	ESTM-8	刺激隔离器+AD/DA转换器
用于脑片支撑的膜滤器	Merk Millipore Ltd., MA, USA	Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,	膜滤器/0.45 13
数值分析软件	Wavemetrics Inc., OR, USA	IgorPro	分析软件
刺激隔离器	WPI Inc.	A395	刺激隔离器
AD/DA转换器	Instrutech	ITC-18	AD/DA转换器
电压敏感染料 Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	目录编号: D-1199	VSD: Di-4-ANEPPS
聚氧乙烯蓖麻油	Sigma-Aldrich	Cremophor EL C5135	聚氧乙烯蓖麻油