小鼠嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录

摘要

来源：Jarriault, D.，等。在完整神经上皮中对小鼠嗅觉感觉神经元进行穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体的神经元的功能分析。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了使用穿孔膜片钳技术对小鼠嗅觉感觉神经元（OSNs）进行电生理记录的方法。从小鼠中分离出含有表达荧光标记气味受体的OSNs的嗅觉上皮组织，并将其固定在记录室中。将记录电极夹持在OSN的树突 knob 部位，电极内的制霉菌素在细胞膜上形成微孔，从而实现与细胞的电学连接。最后，通过另一根电极递送气味刺激物，记录该膜片钳细胞的电生理活动。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 动物

1. 使用杰克逊实验室（Jackson Laboratory）提供的基因工程改造的OR-IRES-tauGFP小鼠（OR = 嗅觉受体，IRES = 内部核糖体进入位点，tauGFP = tau-绿色荧光蛋白）。这些小鼠由Peter Mombaerts博士实验室开发，用于分析嗅觉系统中轴突的靶向与发育。例如，MOR23-IRES-tauGFP品系，货号006643，其正式品系名称为B6;129P2-Olfr16tm2Mom/MomJ；同样，SR1-IRES-tauGFP品系，货号6717，其正式名称为B6;129P2-Olfr124tm1Mom/MomJ。
2. 关于动物年龄：为获得更佳的实验结果，建议使用2至4周龄的小鼠。在此年龄段，解剖操作更为容易（骨骼较软，嗅上皮更坚韧），且与较年长动物相比，其树突末端膨大结构也更为明显。

2. 电极和溶液的制备

1. 对于刺激电极：购买预先拉制好的刺激电极，或手动制备。
   1. 使用火焰将六根直径1 mm的玻璃毛细管在距尖端约1 cm处弯曲。将这六根弯曲的毛细管与一根直的第七根毛细管一起插入带有金属环的1.5 cm热缩管中。
   2. 加热热缩管，使各管体牢固粘合在一起。在管体另一端再套上一段热缩管。使用多通道拉制仪拉制该刺激电极。
   3. 在金属环周围添加一些白色液体胶水，以加固弯曲的尖端。室温下静置过夜（O/N）使其完全干燥。
2. 配制1至2 L正常任氏液（细胞外液，单位为 mM）：NaCl 124，KCl 3，MgSO₄ 1.3，CaCl₂ 2，NaHCO₃ 26，NaH₂PO₄ 1.25，葡萄糖 15；调节pH至7.6，渗透压为305 mOsm。配制后置于4 °C保存，待用。
3. 配制细胞内储存液（单位为 mM）：KCl 70，KOH 53，甲烷磺酸 30，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）5，4-(2-羟乙基)哌嗪乙磺酸（HEPES）10，蔗糖 70；用KOH调节pH至7.2，渗透压为310 mOsm。配制后置于4 °C保存，数周内稳定可用。
4. 实验前即刻（临用前）配制含制霉菌素的细胞内记录液。
   1. 称取3 mg制霉菌素，加入50 µl二甲基亚砜（DMSO）；涡旋振荡20秒，随后超声处理2–3分钟，直至完全溶解。
   2. 取20 µl DMSO-制霉菌素溶液加入5 ml细胞内储存液中。涡旋振荡20秒，再超声处理3分钟。将此溶液置于4 °C保存，并避免直接光照，因制霉菌素对光敏感。该溶液可在数小时内使用，每日更换。
   3. 当嗅觉上皮组织制备完成后置于显微镜下时，用带火焰拉长黄色吸头的1 ml注射器吸取此溶液以填充记录电极；操作过程中避免直接光照。一旦溶液升至室温（RT），制霉菌素溶液不再稳定；应每小时更换注射器中的溶液，或将其始终置于冰上保存。
5. 使用电极拉制仪拉制记录电极，使其具有细长颈部和较小尖端（约2 µm），在填充内部制霉菌素溶液后电阻为15–20 MΩ。
6. 在通风橱中用DMSO配制0.5 M气味分子母液；分装后于-20 °C保存备用。实验时用任氏液稀释至所需浓度，并注入刺激电极中。

3. 嗅觉上皮的制备

注意：OR-IRES-tauGFP 小鼠在 OR 启动子的调控下表达 tauGFP。在这些小鼠中，所有表达目标 OR 的神经元均被 GFP 标记。本方案适用于在所有区域表达的 OR，但对于在背侧区域表达的 OR，解剖和记录操作更为简便。

1. 通过注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（分别为150 mg/kg和10 mg/kg体重）使动物麻醉。对于幼鼠可使用锋利的剪刀进行断头，而对于成年鼠则应使用维护良好的啮齿类动物断头器进行断头。
   1. 使用环形解剖剪在背部皮肤正中线处做纵向切口，将皮肤向两侧拉开。用剪刀在下颌关节处剪断下颌骨，通过与牙齿平行的冠状面切割去除上前牙。
   2. 在眼睛后方对头部做冠状面切割，仅保留头部前段部分。将其浸入冰浴Ringer溶液中，以备在显微镜下进行解剖。
2. 在显微镜下进行解剖：于腹侧沿上颌/牙齿做纵向切口。沿鼻腔背外侧方向纵向剪开背侧骨组织。去除大部分骨组织和腭部结构；将鼻中隔及其附着的上皮组织转移至室温含氧Ringer溶液中。
3. 进行最终解剖：在开始记录前，用镊子将上皮从下方的鼻中隔上剥离。在鼻中隔前部黏附较紧密的区域，使用镊子并配合两处4-5 mm的剪切（使用显微剪刀），将上皮完全分离。
   1. 沿犁鼻器与鼻中隔上皮的背侧连接处小心剪除犁鼻器。将上皮转移至记录室，使黏液层朝上，并用网格固定装置保持其平整。
4. 将记录室安装在配备荧光光学系统和高灵敏度相机的直立显微镜下。通过40倍水浸物镜（数值孔径0.8）以及额外2倍或4倍的放大透镜，在计算机屏幕上以高倍放大观察标本。持续以室温含氧Ringer溶液灌流（1-2 ml/min）。

4. 记录会话

1. 寻找荧光细胞：在480 nm波长下激发EGFP，其发射光范围为530-550 nm；选择一个在荧光和明场下均清晰可见的树突小结进行操作。
2. 用含制霉菌素（nystatin）的细胞内液填充电极；轻轻敲击电极以去除气泡。
3. 将电极插入电极夹持器中，并对移液管施加正压；电极电阻应为15-20 MΩ。
4. 将电极移近细胞；当电阻升至约40 MΩ时，释放正压并施加轻微负压，以形成吉欧封接（gigaseal）。
5. 形成封接后，将膜电位设定在约-75 mV；
6. 细胞破膜后，开始进行刺激程序或药物处理。为测量单次气味分子刺激的反应，先记录200-500毫秒的自发活动，随后施加500毫秒的刺激，并持续记录细胞反应达10秒。进行药物处理时，以目标浓度灌注药物试剂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重型设备
带法拉第笼的振动台	TMC	63-500 系列	必需：将记录系统与环境振动（如实验人员移动、计算机散热风扇等设备振动）隔离开；可选购带法拉第笼的型号，或自行配备定制法拉第笼；建议使用该笼以避免环境电噪声干扰
光学
显微镜	奥林巴斯	BX51WI	配备落射荧光装置的直立显微镜；固定或移动载物台，可根据用户偏好选择
目标	Olympus	LUMPLFL40XW	至少需要两个物镜：一个4倍或10倍物镜用于细胞的粗略定位；另一个40倍浸液长工作距离物镜，例如 Olympus LUMPLFL40XW / IR /0.8 / WD:3.3 MM
放大镜	Olympus	U-TVCAC	绝对必要：置于物镜与相机之间的光路中；可放大屏幕上的图像，以便精确地将记录电极对准旋钮
相机	奥林巴斯	DP72	需要一台性能良好的相机，以便在荧光和明场下观察神经元；控制软件操作简便，可拍摄图像并进行实时摄像，以监测电极接近细胞的过程。无需使用超灵敏相机
滤光片	Olympus/Chroma		根据小鼠所用的荧光蛋白而定；以GFP为例：激发：BP460-490；发射：HQ530/50m
记录电极/系统
放大器	HEKA	EPC10 USB	监测记录电极中流过的电流，并通过向喷雾器发送TTL信号来控制喷 puff；EPC10 设置为 由计算机控制
软件	HEKA	Patchmaster	在实验过程中控制放大器
显微操作仪	Sutter	MP225	精密显微操作器，可实现低至十分之一微米的精确移动；该型号非常稳定；避免使用可能产生漂移的液压操作器
电极拉制仪	Sutter	P97	使用FT345-B宽槽丝；制备约2的记录电极µ微米直径，具长尖端以接触细胞；使用穿孔膜片钳溶液时，电阻应为15至20 MΩ
玻璃	Sutter	BF120-69-10	在我们的记录条件下，这种玻璃是制作记录电极的理想材料
记录室	Warner Instruments	RC-26G	需要一个腔室将制备样本置于显微镜下。为使样本保持在腔室中央，应使用网状固定装置或锚定装置。
刺激
玻璃	WPI	TW100F-4	以每组7支成捆，这些移液管用于制备预拉制的刺激电极
多通道微电极拉制仪	MDI	PMP-107-Z	通过拉伸与扭转的结合，该拉制仪使我们能够制备具有7个管腔的充气电极
精密压力注射器	图希公司	P/N T25-1-900 单通道	该精密压力注射器用于控制在多通道拉制仪中施加的压力；可通过手动或放大器以5V TTL信号进行控制
显微操作仪	Narishige	YOU-1	粗调操纵器足以将喷射电极移近记录位点
管路
溶液/灌流/化学品
真空泵	gardner denver
灌注系统	N/A	N/A
制霉菌素	Sigma-Aldrich	N3503	制备穿孔膜片钳的内液是必需的
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D5879	用于溶解制霉菌素，配制穿孔膜片记录的胞内溶液
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9625	细胞外液
氯化钾	Sigma-Aldrich	P4504	细胞内/细胞外溶液
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C7902	细胞外液
磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	细胞外液
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4 7H2O	Sigma-Aldrich	63140	细胞外液
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	细胞外液
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297	细胞外液
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）′，N′- 四乙酸	Sigma-Aldrich	E3889	内液
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	P1767	内液
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	W387509	细胞内液
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	细胞内液
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389	细胞内液