使用光纤光度法记录自由活动小鼠的神经活动

摘要

来源：Martianova, E., 等. 在自由活动动物中记录神经活动的多光纤光度法. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种利用光纤光度法在自由活动的小鼠中记录神经活动的方法。该方法中，特定脑区的神经元表达一种基因编码的钙离子指示剂。对该脑区施加刺激，并测量荧光强度随刺激依赖性的变化，从而识别神经活动。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. CMOS（互补金属氧化物半导体）相机与单根或分支光纤跳线之间光路的对准

1. 松开五轴调节架上的所有螺丝（图1B）。
2. 将光纤跳线（图1B）旋入固定在五轴调节架上的适配器［SMA（亚微型A型）或FC（光纤连接器）］中。
3. 以低功率（100 μW）开启470 nm激发光源（图1B），并将跳线末端对准一块自发荧光塑料载片。此步骤不影响后续记录，仅用于可视化对准过程。
4. 以实时模式记录CMOS相机（图1B）的图像。增加增益或调整查找表（LUT），直至图像不再全黑。目的是能够在物镜的焦平面上观察到清晰的图像（图1B）。
5. 推进五轴调节架靠近物镜，确保470 nm光在跳线SMA或FC端的光纤中心位置，直至相机上可分辨出图像。
6. 调节X轴和Y轴，使图像居中且清晰聚焦。
7. 观察跳线陶瓷插芯端发出的光，应呈现为各向同性的圆形光斑。若使用分路跳线，各跳线陶瓷插芯端发出的光强应相近。若光斑非各向同性或发光强度不均，需调节五轴调节架的X-Y轴方向。

2. 围绕纤维设置感兴趣区域以测量平均荧光强度

1. 打开所有激发光源，以更清晰地观察光纤。调节相机增益，确保无像素饱和，并能获得清晰的光纤图像。
2. 进行实时记录或拍摄初步图像。
3. 在光纤周围绘制感兴趣区域（ROI），并在记录过程中保留这些区域，用于测量平均荧光强度值（图 1A）。
4. 对于多光纤记录，需检测信号之间的独立性。
   1. 对所有光纤进行实时记录。
   2. 将其中一根光纤对准光源，并用手指轻敲。仅该通道应出现明显波动（可接受的串扰比例为 1:1000）。
   3. 若信号不独立，需重新绘制更保守的感兴趣区域，并重复独立性检测。
5. 为标记和追踪每个感兴趣区域对应的光纤，可在光纤末端粘贴彩色胶带或涂抹指甲油。在实验开始前拍摄照片，作为辅助参考。

3. 记录区域的设置

1. 使用支架、夹子或固定器将光纤跳线悬挂在实验区域上方。
2. 确保动物能够在整个实验区域内自由活动，不受光纤长度的限制。
3. 若使用操作箱或开放场地，需确保光纤跳线能够到达动物且弯曲程度最小。如果需要进行鼻触操作，应保证动物上方有足够的空间，以防止光纤弯曲。避免光纤跳线出现过度弯曲或扭转。

4. 体内记录

1. 用肉眼和微型光纤显微镜检查光纤跳线末端的光纤表面。如果光纤表面有划痕，使用细粒度（1 μm 和 0.3 μm）的光纤抛光/研磨膜重新抛光光纤。
2. 用70%乙醇和棉签清洁光纤跳线的远端。
3. 用70%乙醇和棉签清洁光纤插管。
4. 将光纤跳线的卡环端通过覆盖黑色热缩管的陶瓷分体套管连接至已植入的光纤上。确保连接时套管紧密贴合，否则应更换新的套管。
   注意：若光纤跳线卡环与植入物之间存在间隙，将导致大量信号损失，无法正常记录。
5. 在开始行为学测试前，让动物恢复数分钟。
6. 开始光学信号记录并运行实验。
7. 记录过程中，密切观察实时信号轨迹以确保记录质量。信号在记录开始后的前2分钟内会随时间迅速下降，此现象由LED的热致衰减引起，即温度升高导致光学元件电阻增加所致。
8. 若信号出现超出GCaMP开/关动力学范围的跳跃，通常表明套管连接不够紧密，导致光纤跳线与植入物之间的间隙发生变化。此时应停止实验，并更换新套管后重新连接动物。

结果

图1：光纤光度测量示意图。（A）来自两个LED（410 nm和470 nm）的激发光经过一系列滤光片和二向色镜后，在20倍物镜的工作距离处形成一个激发光斑。激发光通过单根光纤或成束光纤（用于多部位记录）传输至植入的套管。发射的荧光由同一根光纤收集，经过滤光后投射到CMOS相机传感器上。在采集的图像中，记录每根光纤所在感兴趣区域（ROI）的平均荧光强度。系统采用时分复用技术，以同时获取410 nm和470 nm LED的信号（右下角示意图）。（B）我们自制的光度测量系统及其组件照片：（1）连接至465 nm LED的光纤，（2）连接至405 nm LED的光纤，（3）准直器，（4）470 nm带通滤光片，（5）410 nm带通滤光片，（6）535 nm带通滤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1/4"-20 不锈钢帽头螺钉，1 个" 长	Thorlabs	SH25S100
1/4"-20 不锈钢帽头螺钉，1/2" 长	Thorlabs	SH25S050
1/4"-20 不锈钢帽头螺钉，3/8" 长	Thorlabs	SH25S038
1000 µm，0.50 数值孔径，SMA-SMA 光纤连接线	Thorlabs	M59L01
12.7 mm 光学支架	Thorlabs	TR30/M
12.7 mm 底座支架夹持器	Thorlabs	PH20EM
15 V，2.4 A 电源供应单元 T-Cube 用 3.5 mm 耳机插孔连接器	Thorlabs	KPS101
20倍物镜	Thorlabs	RMS20X
带二向色滤光片支架的30 mm笼式立方体	Thorlabs	CM1-DCH/M
405 nm LED	Doric Lenses	CLED_405
410 nm带通滤光片	Thorlabs	FB410-10
465 nm LED	Doric Lenses	CLED_465
470 nm 带通滤光片	Thorlabs	FB470-10
560 nm 带通滤光片	Semrock	FF01-560/14-25
560 nm LED	Doric Lenses	CLED_560
五轴运动学支架	Thorlabs	K5X1
消色差双合透镜	Thorlabs	AC254-035-A-ML
405 准直器适配器	Thorlabs	AD11F
可调准直器适配器	Thorlabs	AD127-F
铝制光学平台	Thorlabs	MB1824
夹紧叉	Thorlabs	CF125
立方连接器	Thorlabs	CM1-CC
双通道493/574二向色镜	Semrock	FF493/574-Di01-25x36
GCaMP6发射滤光片	Semrock	FF01-535/22-25
使用黑色硬质纤维板围封	Thorlabs	XE25C9
用于加工的外螺纹SM1端盖	Thorlabs	SM1CP2M
快速更换SM1透镜管滤光片支架	Thorlabs	SM1QP
405 nm 光源固定准直器	Thorlabs	F671SMA-405
用于470和560 nm光的固定准直器	Thorlabs	F240SMA-532
绿色发射滤光片	Semrock	FF01-520/35-25	光束分束器
高分辨率USB 3.0 CMOS相机	Thorlabs	DCC3260M
光束分束器	Neurophotometrics	SPLIT
长通二向色镜，425 nm 截止	Thorlabs	DMLP425R
长通二向色镜，495 nm 截止	Semrock	FF495-Di03
Metabond 牙科水泥	C&B
M8 - M8 电缆	Doric Lenses	Cable_M8-M8
光纤套管	Doric Lenses		需明确说明这些材料将用于需要低自发荧光的光度测定实验
光纤跳线	Doric Lenses		需明确说明这些材料将用于需要低自发荧光的光度测量实验
红色发射滤光片	Semrock	FF01-600/37-25	光束分束器
T7 LabJack	LabJack
T-cube LED 驱动器	Thorlabs	LEDD1B
USB 3.0 I/O 电缆，Hirose 25，适用于 DCC3240	Thorlabs	CAB-DCU-T3