小鼠脑切片中视网膜丘脑和皮层丘脑突触的电生理学研究

摘要

来源：Chen, X.，等。视网膜-外侧膝状体及皮层-外侧膝状体突触功能的电生理研究。J. Vis. Exp. (2019)。

该视频介绍了在小鼠脑切片中对视网膜-外侧膝状体突触和皮层-外侧膝状体突触进行电生理记录的方法。包含背侧外侧膝状体核（dLGN）的脑切片被置于记录室中。刺激电极可放置于视束上，以刺激视网膜神经节细胞（RGCs）并研究视网膜-外侧膝状体突触；或放置于丘脑网状核，以刺激皮层神经元并研究皮层-外侧膝状体突触。刺激后，RGCs 和皮层神经元释放兴奋性神经递质，从而在外侧膝状体核的中继神经元中产生突触电流。这些电流通过膜片钳记录电极进行记录。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 溶液

1. 解剖液
   1. 为减少兴奋性毒性，在解剖过程中使用一种胆碱基溶液，其成分为（单位：mM）：87 NaCl、2.5 KCl、37.5 胆碱氯化物（choline chloride）、25 NaHCO₃、1.25 NaH₂PO₄、0.5 CaCl₂、7 MgCl₂ 和 25 葡萄糖。解剖液应在实验前一周内配制。
2. 记录液
   1. 配制人工脑脊液（ACSF），其成分为（单位：mM）：125 NaCl、25 NaHCO₃、1.25 NaH₂PO₄、2.5 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂ 和 25 葡萄糖。加入 50 µM D-2-氨基-5-磷酸戊酸（D-APV）和 10 µM SR 95531 氢溴酸盐（gabazine），以分别阻断 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和 GABAA 受体。
3. 细胞内液
   1. 配制细胞内液，其成分为（单位：mM）：35 Cs-葡萄糖酸盐（Cs-gluconate）、100 CsCl、10 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、10 乙二醇四乙酸（EGTA）和 0.1 D-600（甲氧维拉帕米盐酸盐，methoxyverapamil hydrochloride）。用 CsOH 将 pH 值调节至 7.3。过滤后分装，将储备液保存于 -20 °C，直至使用。

2. 解剖

1. 准备两个切片用容器，其中一个加入100 mL解剖液，另一个加入100 mL记录液。将两个烧杯置于37 °C水浴中，并用碳氧混合气（carbogen）持续通气至少15分钟，以在解剖前充分氧合溶液。
2. 取一个塑料烧杯，加入250 mL接近冰温（但未结冰）的解剖液。使用前至少用碳氧混合气通气15分钟。
3. 取一个塑料培养皿（100 mm × 20 mm），用于脑组织解剖，其中加入冷的解剖液。将一片滤纸放入培养皿盖内。
4. 将振动切片机的解剖腔室预冷。
5. 使用2.5%异氟烷对小鼠进行麻醉，例如在小鼠笼内实施。当小鼠对尾部夹捏无反应时，迅速在延髓颈交界处剪断头部，并将头部立即浸入培养皿底部的冰冻解剖液中。
6. 从尾侧向鼻侧剪开头皮，并用手指将其向两侧拉开以暴露颅骨。为取出前脑，首先沿前后中线切开颅骨，然后分别沿冠状缝和人字缝再进行两次切割（图1A）。
7. 移除冠状缝与人字缝之间的颅骨，暴露大脑半球。用精细刀片切除嗅球，并将前脑与中脑分离（图1B）。用薄刮铲将脑组织从颅骨中取出，置于培养皿盖内的滤纸上。
   注意： 步骤2.6和2.7应尽快完成，以减少细胞死亡。
8. 为在脑片中保留外侧膝状体背侧核（dLGN）的感觉输入和皮层输入的完整性，需以3−5°的角度进行旁矢状切以分离两个大脑半球（图1C, D）。将两个半球的内侧-外侧切面置于滤纸上吸干，然后以水平面10−25°的角度将其粘附于切片台上（图1E）。
9. 将切片台置于金属缓冲槽中央，并轻轻将剩余的冰冻解剖液倒入缓冲槽中。操作时需格外小心，以免强力倾倒导致粘附的脑组织脱落（图1F）。
10. 将缓冲槽放入盛有冰块的托盘中，以维持解剖过程中的低温环境。使用剃刀刀片以0.1 mm/s的速度和1 mm的振幅切出250 µm厚的脑片。
11. 将脑片置于孵育室中，在34 °C、持续通氧的解剖液中保存约30分钟，随后转移至34 °C的记录液中继续恢复30分钟。
12. 恢复完成后，将脑片孵育室从水浴中取出，之后脑片可在室温（RT）下保存，直至用于实验。

3. 电生理学

1. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管和拉针仪制备电极。记录电极的电阻应维持在 3−4 MΩ。刺激电极采用相同程序制备，但在拉制后需轻微折断尖端以增大直径。记录电极内充灌细胞内液和生物胞素，刺激电极则充灌记录液。
2. 将脑片置于记录室中，并在室温下持续灌注含氧的记录液。检查所有脑片，选择视束结构完整的脑片进行实验。
3. 使用配备红外差分干涉（IR-DIC）视频显微镜的直立显微镜观察脑片和细胞。
   注意： 中继神经元可通过其较大的胞体和更多的初级树突（从胞体发出的分支）与中间神经元相区分。中间神经元呈双极形态，胞体较小。
4. 在用记录电极对细胞进行膜片钳制之前，先将刺激电极放置于脑片上。为研究视网膜-丘脑突触，将刺激电极直接置于视束上，此处为视网膜神经节细胞轴突纤维的聚集区域（图 2A）。为分析皮层-丘脑突触，则将刺激电极置于丘脑网状核，该核团位于背外侧膝状体（dLGN）的嘴侧腹方（图 2B）。
5. 当记录电极浸入记录液后，施加 5 mV 电压阶跃以监测电极电阻。将钳制电位设为 0 mV，并调零偏移电位，使钳制电流为 0 pA。
6. 在向细胞靠近时，对记录电极施加正压。当电极与细胞膜直接接触后，释放正压，并将钳制电位设为 -70 mV。施加轻微负压，使细胞膜贴附于玻璃电极，形成吉欧姆封接（电阻 >1 GΩ）。补偿电极电容后，通过施加负压脉冲破膜。
7. 为研究突触功能，通过刺激电极施加 0.1 ms 的电流脉冲（约 30 µA）。若未观察到突触反应，可能需要更换刺激电极。在移动刺激电极位置时需格外小心，避免丢失已记录的细胞。
   注意： 在 图 2 所示的示例记录中，通过以 30 ms 的刺激间隔连续两次刺激视束或皮层-丘脑纤维来研究突触短时程可塑性。配对脉冲比（PPR）通过将第二次兴奋性突触后电流（EPSC）的幅度除以第一次 EPSC 的幅度（EPSC2/EPSC1）计算得出。每种刺激方案重复 20 次，EPSC 幅度由 20 次扫描的平均电流测量获得。每次重复之间的间隔至少为 5 s，以避免重复刺激引起的短时程可塑性。
8. 通过施加 5 mV 电压阶跃持续监测串联电阻。仅选用串联电阻小于 20 MΩ 的细胞进行数据分析。

结果

图 1： 解剖操作流程示意图。（A）小鼠颅骨的水平视图，显示初始切割的位置。第一次切割沿矢状缝进行，随后分别沿冠状缝和人字缝进行另外两次切割。虚线表示切口位置。（B）完整脑组织的矢状视图。虚线表示大脑半球从嗅球和中脑分离。（C-D）这些图示分别从水平（C）和冠状（D）视角展示分离两个脑半球时的首次切割角度。（E）一个脑半球在切片台上的冠状视图。虚线表示切片方向。l、m、d 和 v 分别代表图 D 和 E 中脑半球的外侧、内侧、背侧和腹侧。（F）解剖室示意图，显示两个脑半球置于切片台上。虚线箭...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	HEKA Elektronik	EPC 10 USB 双膜片钳放大器
CaCl₂	EMSURE	1.02382.1000
氯化胆碱	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
共聚焦激光扫描显微镜	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-葡萄糖酸盐	自行制备		由于无市售的Cs-葡萄糖酸盐，我们自行制备
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG
D-APV	Biotrend	BN0085-100
显微镜用数码相机	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
葡萄糖	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
高电流刺激隔离器	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl₂	EMSURE	1.05833.0250
显微操作器	Luigs & Neumann	SM7
显微镜	Olympus	BX51
封片剂	ThermoFisher Scientific	P36930
NaCl	ROTH	3957.1
NaH₂PO₄	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO₃	EMSURE	1.06329.1000
移液管	Hilgenberg	1807502
拉制仪	Sutter	P-1000
剃须刀片	Personna	60-0138
半自动振动切片机	Leica Biosystems	VT1200S
SR 95531 氢溴酸盐	Biotrend	AOB5680-10	GABAA受体拮抗剂