小鼠海马脑片中神经元的光刺激与全细胞膜片钳记录

摘要

来源：Richevaux, L.，等。在体小鼠脑切片中通过颅内立体定位注射实现长程神经输入的光遗传学刺激。J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了一种研究转染小鼠海马脑片中突触相互作用和神经元反应的实验方案。该方法包括通过光照激活远距离感觉神经元以诱发动作电位，并利用全细胞膜片钳技术记录目标神经元中产生的兴奋性突触后电位。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 急性脑片记录用溶液

1. 在电生理实验前，使用纯去离子水配制 10 倍人工脑脊液（aCSF）储备液（124 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO₃、1 mM NaH₂PO₄ 和 11 mM D-葡萄糖）。将该溶液储存于 1 L 瓶中，4 °C 保存，不含 CaCl₂ 和 MgCl₂。
2. 配制基于葡聚糖酸钾的移液管溶液，其中包含 135 mM K-葡聚糖酸、1.2 mM KCl、10 mM HEPES、0.2 mM EGTA、2 mM MgCl₂、4 mM MgATP、0.4 mM Tris-GTP、10 mM Na₂-磷酸肌酸以及 2.7–7.1 mM 生物胞素，用于后续细胞形态学鉴定。调节溶液 pH 至 7.3，渗透压至 290 mOsm。将 1 mL 分装液于 -20 °C 保存。

2. 全细胞膜片钳记录

1. 使用自制的玻璃转移移液管，将含有海马复合体的脑切片轻柔转移至直立显微镜上的记录室。转移移液管由截短的巴斯德移液管（内径 6.5 mm）连接橡胶吸头制成。持续用 34 °C（预热）的 aCSF 灌流记录室（3 mL），aCSF 用 95%/5% O₂/CO₂ 气体饱和。设定蠕动泵流速为 2–3 mL/min。
2. 使用蓝光 LED（470 nm）照射，短暂观察目标区域轴突末梢中 Chronos-GFP 的表达情况，并用 4 倍物镜进行观察。通过合适的发射滤光片观察 GFP 荧光，并由 CCD 相机将图像显示在计算机屏幕上。
3. 将由 U 形铂丝和紧密排列的尼龙线（“琴弦”）制成的切片固定器置于切片上，以固定切片位置。
4. 切换至 63 倍浸液物镜并调节焦距。检查表达 Chronos-GFP 的轴突，选择一个锥体神经元进行膜片钳记录。
5. 将物镜向上移动。
6. 使用布朗-弗莱明电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管拉制移液管。拉制仪设定为制备尖端直径约 1 μm 的移液管。用基于 K-葡萄糖酸盐的内液填充移液管。
7. 将移液管安装在头架的移液管夹持器上。将移液管下放至记录室中，并在物镜下找到其尖端。移液管电阻应在 3–8 MΩ 之间。使用注射器施加轻微正压，使溶液从移液管尖端形成锥形流出，随后逐步降低移液管和物镜至切片表面。
8. 以电压钳模式进行细胞封接：接近已识别的神经元，轻柔地将移液管尖端压在胞体上。正压应在膜表面形成凹陷。释放压力以形成吉欧姆封接（>1 GΩ 电阻）。封接成功后，将钳制电压设为 -65 mV。通过施加短暂的负压脉冲击穿膜结构：可通过向连接移液管夹持器的管道施加强力吸力实现。
9. 在全细胞电流钳模式下记录神经元对超极化和去极化电流阶跃的反应（图 1A）。
   注意：本方案用于测定细胞的主动与被动内在电生理特性。离线分析使用自编的 MATLAB 程序进行。
10. 记录传入纤维表达 Chronos 时，对全视野 475 nm LED 刺激产生的电流钳或电压钳突触后反应。以 20 Hz 频率施加 10 次、每次持续 2 ms 的刺激脉冲串（图 1 B, C）。光强可在 0.1–2 mW 范围内调整。
    注意：光强使用配备光电二极管传感器的数字手持式光功率计测量，传感器置于物镜下方。2–4 ms 的反应潜伏期是单突触连接的典型特征。

结果

图1：压后皮层III层神经元：固有特性、丘脑传入纤维光刺激反应及细胞形态的事后揭示。（A）III层神经元在超极化和去极化电流脉冲下的放电模式和膜电位变化。（B, C）III层神经元对丘脑轴突2 ms光刺激（蓝色条）的反应，分别在（B）电流钳和（C）电压钳模式下记录。（D, E）压后皮层浅层水平切片中，表达Chronos-GFP（绿色）的丘脑轴突环绕的III层锥体神经元（白色，由实心黄色三角标示），DAPI染色（蓝色），使用落射荧光显微镜成像（D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KCl	Sigma	P4504	终浓度 1.2 mM
氯化镁	Sigma	63069	终浓度 2 mM
MultiClamp 700B	Axon Instruments
pClamp 数据采集软件	Axon Instruments
蠕动泵	Gilson	Minipuls 3	显示屏设置为 14-16，流速 2-3 ml/min
葡萄糖酸钾（K-gluconate）	Sigma	G4500	终浓度 135 mM
硼硅酸盐毛细管	Havard Apparatus	GC150-10	外径 1.5 mm，内径 0.86 mm
Brown Flaming 电极拉制仪	Sutter Instruments	P-87
EGTA	Sigma	E4368	终浓度 0.2 mM
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED DC/59022m	需搭配 470/40x 激发滤光片及 GFP 发射滤光片使用
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	批号 V6026R，qTiter GC/ml 4.912e12，ddTiter GC/ml 2.456e13
CCD 相机	Andor	DL-604M
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM710	20X
Digidata 1440A	Axon Instruments
手持式数字光学功率计	ThorLabs	PM100D	设定波长为 475 nm
HEPES	Sigma	H3375	终浓度 10 mM
LED 电源	Cairn Research	OptoLED Light Source