脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

摘要

来源： Murphy, C. A.，等 脑切片中传入通路的光遗传学激活及挥发性麻醉剂对反应的调节。J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 多通道记录的硬件与软件准备

1. 根据制造商说明设置一个16通道数据采集系统。
   注意： 可使用多种市售的放大器和数据采集系统来收集多通道记录。在本实验中，模拟信号通过电极参考板传送到两个放大器，在其中被放大（2000倍）并滤波（0.1–10 kHz）。数据采集系统的模拟输入以40 kHz进行数字化。
2. 将合适的16通道前置放大器适配器固定到显微镜微操纵器上。调整适配器方向，使母连接端口朝下。
3. 调节该微操纵器的操作角度，使其相对于水平面以约70°的角度向下指向记录室。
4. 通过固定在微操纵器上的前置放大器适配器，将前置放大器输入端连接至用于体外电生理记录的16 × 1探针。
5. 将前置放大器输出连接器连接至数据采集系统。
6. 安装适当的数据采集软件。将15个输入通道配置为对应于前15个多通道探针触点的输入信号，剩余一个通道配置为接收细胞内电极的输入信号。
   注意： 在采集和分析数据时，务必参考电极和适配器的通道分布图，以确保每个信号与其采集所用的电极触点正确对应。

2. 光刺激方案的配置

1. 设置光传递系统并安装配套软件。
2. 打开软件。选择一种硬件接线配置，其中触发源（数字/TTL（晶体管-晶体管逻辑）输出）向光传递系统提供触发输入信号，而光传递系统则向470 nm LED（发光二极管）提供触发输出信号。
3. 安装高倍物镜。使用数字相机，将高倍物镜与光传递系统进行校准。
4. 创建一组新的光刺激模式序列。
   1. 创建所需模式。在本实验中，直径为150 µm的圆形可用于特异性激活特定层的轴突末梢。
   2. 通过复制和粘贴该模式，为任意数量的试验构建模式序列。
   3. 创建一个波形列表，其中包含任意光强度、脉冲持续时间或脉冲次数的波形。
   4. 将波形随机分配给每个模式。每个模式及其分配的波形对应于一个来自数字TTL输入的触发脉冲或一次试验。
   5. 保存该模式序列。
5. 在数据采集软件中创建新协议。
   1. 设置试验次数，使其等于所创建模式序列中的模式数量。
   2. 选择与步骤1.6中配置相匹配的信号输入。配置一个协议，提供单个数字TTL输出，并在数字触发前后适当的时间段内记录这16个输入通道的信号。

3. 将多通道探针放置于离体脑组织切片中

1. 以3-6 mL/min的流速灌注已通入气体的eACSF（实验用人造脑脊液）（不要使用密封袋装的溶液）。
2. 将含有目标区域的脑片转移至显微镜灌流 chamber 中的网格支架上，并用铂金制琴弦固定器锚定。
3. 旋转网格支架，使多通道探针远端电极触点的连线大致与软脑膜表面垂直。
4. 在宽场照明和显微操作器精细控制下，将多通道探针缓慢下移至脑片表面附近。
5. 转动滤光块转盘，选择合适的滤光块组合，以观察皮层传入纤维轴突末梢中表达的荧光报告蛋白。如有必要，可旋转脑片以更精确地使探针与软脑膜表面对齐。
6. 将探针置于略高于脑片平面的位置，沿x轴方向距离最终目标位置约200 µm，并确保至少有一个通道位于记录组织区域边界之外。
7. 通过沿探针纵轴移动操作器，缓慢将其插入脑片。为尽量减少对组织的损伤，仅推进至锐利探针尖端刚好可见于组织表面之下即可。此操作可在确保电极触点与组织接触的同时，最大程度减少组织损伤。

4. 对靶向神经元进行膜片钳记录并获得全细胞构型

1. 将eACSF的来源切换至袋装的对照溶液。
2. 识别荧光标记的细胞，用于靶向膜片钳记录。
   1. 将孔径虹膜光圈调节至最小直径。使用低倍物镜，并将组织调至焦点。
   2. 将光线居中对准多通道探针附近但不重叠的组织区域。
   3. 切换至高倍（40x或60x）水浸物镜，操作时需小心，避免多通道探针与物镜接触。
   4. 旋转滤光片转轮，选择合适的滤光片组，以便成像表达Cre依赖性荧光标记的细胞。
   5. 确定一个荧光标记的细胞作为膜片钳记录的目标。抬升物镜，为降低膜片电极留出足够空间。
3. 将膜片电极（见表1）用内液（见表2）灌注，并安装至电极夹持器中。使用1 mL注射器施加约0.1 mL空气对应的正压。
4. 将膜片电极放入溶液中。在视觉引导下将电极尖端调至焦点。
5. 按照先前已演示的步骤33，从目标细胞获取全细胞记录。
6. 若计划评估细胞内在特性的变化（例如输入电阻、对电流阶跃的峰电位发放频率），则进行这些记录；否则，转入下文的轴突刺激方案。

表1：人工脑脊液和细胞内溶液的组成。列出了用于eACSF以及用于膜片钳记录的细胞内移液管溶液的试剂及其浓度。

	实验用人工脑脊液，eACSF（单位：mM）
NaCl	111
NaHCO3	35
HEPES	20
KCl	1.8
CaCl2	2.1
MgSO4	1.4
KH2PO4	1.2
glucose	10
	细胞内液
K-gluconate	140
NaCl	10
HEPES	10
EGTA	0.1
MgATP	4
NaGTP	0.3
	pH = 7.2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.5倍广视野物镜	Olympus	MPLFLN2.5X
40倍水浸物镜	Olympus	LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 混合气体	Airgas	Z02OX95R2003045
A16 探针	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16通道探针
麻醉气体监测仪（POET II）	Criticare	602-3A
氯化钙（CaCl₂）	点科学	DSC20010	ACSF
毛细玻璃管（膜片钳记录）	King Precision Glass, Inc.	KG-33	硼硅酸盐玻璃管，内径：1.1 mm，外径：1.7 mm，长度：90.0 mm
毛细玻璃管（病毒注射）	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3.5"
控制初级显微操作仪	Luigs and Neumann	SM8	用于控制初级显微操作器
机械臂控制与移位台	Luigs and Neumann	SM7	用于多通道电极和移位台的控制
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	数字化仪和软件
E-3603 管路	Fisher Scientific	14171208	用于向孵育室输送95% O2/5% CO2气体混合物 + 膜片钳记录过程中施加压力
EGTA	点科学	DSE57060	细胞内液
ERP-27 脑电图参考/连接面板	Neuralynx	已退休
填充针	World Precision Instruments	50821912	用于填充膜片钳移液管
用于成像EYFP的滤光片组	Olympus	U-MRFPHQ
滤纸	Fisher Scientific	09801E	制备组织块时将切片模板覆盖于其上
弗拉明/布朗微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P-1000	2.5x2.5 盒式灯丝
气体分散管	Sigma Aldrich	CLS3953312C
玻璃注射器（100 mL）	Sigma Aldrich	Z314390	用于填充密封气体袋
葡糖酸钾（K-葡糖酸盐）	Dot Scientific	DSG37020	细胞内液
葡萄糖	点科学	DSG32040	ACSF
GTP，钠盐	Sigma Aldrich	G8877	细胞内液
头端探针适配器	NeuroNexus	A16-OM16	连接16通道探针与前置放大器输入端的适配器
HEPES	点科学	DSH75030	人工脑脊液，细胞内溶液
HS-16 头戴式装置	Neuralynx	已退休
异氟烷	Patterson Veterinary	07-893-1389
异丙醇（70%）	VWR International	101223-746
初级显微操作仪	Luigs 和 Neumann	210-100 000 0090-R	用于膜片钳电极的操作
LED光源控制模块	Mightex	BLS-PL02_US	光遗传学光源控制
Lynx-8 放大器	Neuralynx	已退休
Lynx-8 电源供应器	Neuralynx	已退休
硫酸镁（MgSO₄）	点科学	DSM24300	ACSF
mCherry，德克萨斯红滤光片组	Chroma	49008	用于成像 tdTomato 荧光报告基因
美洛昔康
微量移液器架	Fisher Scientific	NC9044962
微量注射泵	World Precision Instruments	UMP3-4
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	放大器
氮气（用于气浮台）	Airgas	NI200
尼龙网	Fisher Scientific	501460083	拉伸在扁平铂丝制成的马蹄形支架上，记录时组织切片置于其上
尼龙，取自连裤袜	通用品牌		小块琼脂糖用于在孵育室中制作切片平台，单根铂丝用于制作铂金丝网
移液器	Dot Scientific	307	用于将组织转移至仪器装置
铂丝	VWR International	BT124000	2 cm，压平，制成铂金竖琴状
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	光遗传学光照递送系统，配备 PolyScan2 软件
氯化钾（KCl）	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
磷酸二氢钾（KH2PO4）	点科学	DSP41200	ACSF
密封气体袋	Fisher Scientific	109236
显微镜用移位台	Luigs and Neumann	380FMU
碳酸氢钠（HCO3-）	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
氯化钠（NaCl）	Dot Scientific	DSS23020	人工脑脊液，细胞内液
带鲁尔锁接头的注射器（1 mL）	Fisher Scientific	309628	用于膜片钳实验中施加压力
1 mL 带滑动接头的注射器	WW Grainger, Inc.	19G384	用于填充膜片钳移液管
注射器滤器	VWR International	66064-414
直立显微镜	奥林巴斯	BX51
Wypall 纸巾	Fisher Scientific	19-042-427