通过VTA多巴胺能神经元受体操控的大鼠模型监测多巴胺释放

摘要

来源：Wickham, R. J.，等。结合输注与刺激的快速扫描循环伏安法（CIS-FSCV）评估腹侧被盖区受体对多巴胺瞬时释放的调控。J. Vis. Exp. （2020）。

本视频展示了在麻醉大鼠中植入电极和套管，以使用恒电位仪测量伏隔核中的多巴胺释放，并通过向腹侧被盖区输注药物来调节多巴胺能活性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 术前准备

1. 电极溶液的配制
   1. 配制电极填充液时，制备含有140 mM氯化钾的4 M醋酸钾溶液。
2. 电极的制备
   1. 使用真空负压，将一根T-650型碳纤维（直径为7 µm）插入硼硅酸盐玻璃毛细管（长度 = 100 mm，外径 = 1.0 mm，内径 = 0.5 mm）中。
   2. 将碳纤维置入玻璃毛细管后，将毛细管放入垂直电极拉制仪中，使加热元件大致位于毛细管中部。将加热器设定为55，磁体保持关闭状态。
   3. 拉制完成后，小心抬高上部毛细管夹持器，确保电极尖端不再被加热元件包围。
   4. 使用锋利的剪刀剪断仍连接两段毛细管的碳纤维，从而得到两个独立的碳纤维微电极。
   5. 在光学显微镜下，用锋利的手术刀小心地切割暴露的碳纤维，使其超出玻璃末端约75–100 µm。
   6. 在光学显微镜下检查，确保毛细管表面无裂纹，且碳纤维从毛细管引出处的密封良好、难以察觉，并无裂纹。
      注意：良好的密封有助于降低记录过程中的噪声。
3. 参比电极的制备
   1. 将一根金针焊接到一段5 cm长的银丝上。
   2. 将阳极连接至金属回形针或其他导体，阴极连接至金针，在回形针和银丝浸入0.1 M HCl溶液的同时施加约2 V的电压。
   3. 当银丝表面出现白色涂层（AgCl）时，停止施加电压。
4. 电极植入前的准备
   1. 将一根金针焊接到一根细的绝缘导线（长约10 cm，<0.50 mm直径）上。
   2. 从与金针相对的一端去除约5 cm的绝缘层。
   3. 用电极溶液填充电极约一半体积。
   4. 将绝缘导线插入电极中。
      注意：导线应与电极内部的碳纤维接触良好。

2. 电极植入

1. 给成年雄性Sprague Dawley大鼠（250−450 g）腹腔注射1.5 g/kg（或1 mL/kg体积）的无菌生理盐水中溶解的乌拉坦（浓度为0.5 g/mL）。初始乌拉坦剂量为1.0−1.2 g/kg。若在注射乌拉坦20 min后，动物对有害刺激试验（尾夹）仍有反应，则追加注射0.3−0.5 g/kg乌拉坦，使总剂量达到1.5 g/kg。
   注意： 配制0.5 g/mL的乌拉坦溶液时，将10 g乌拉坦加入10 g（约10 mL）生理盐水中。乌拉坦为致癌物，必须小心操作。然而，它是一种重要的麻醉剂，因其不会像其他麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪和水合氯醛）那样改变多巴胺水平。
2. 待动物深度麻醉且对有害刺激（如脚趾挤压）无反应后，将其置于立体定位仪中。为大鼠双眼涂抹眼用润滑剂。
   注意： 这是一台非存活手术，但建议采用良好的无菌技术。
3. 使用两步法擦洗大鼠头皮（即先用聚维酮碘擦洗，再用70%乙醇擦洗；重复3个循环）。
4. 使用无菌尖头镊子和手术剪切除头皮组织。去除足量组织，以为下方所述的各种植入操作留出空间。
5. 使用无菌棉签轻轻清洁颅骨表面。然后滴加2−3滴3%过氧化氢，以帮助识别人字缝和前囟。
6. 使用立体定位仪或手持钻（1.0 mm，约20,000 rpm），在前囟前2.5 mm、外侧3.5 mm处钻一个直径为1.5 mm的孔。将一颗螺钉（外径1.59 mm，长3.2 mm）部分植入该孔中（约植入一半深度，直至其牢固固定）。建议在钻孔过程中使用无菌生理盐水冲洗，以防止热损伤。
7. 在左侧半球，于前囟前1.5 mm、外侧3.5 mm处钻一个直径为1.0 mm的孔，用于放置参考电极。
8. 用手将约 2 mm 的参考电极导线插入该孔中，同时将参考电极导线缠绕在植入螺钉的头部下方。
9. 完全植入螺钉，将参考电极固定到位。
10. 在右侧半球，于冠状缝前 1.2 mm、外侧 1.4 mm 处钻一个直径为 1.5 mm 的孔。
11. 用镊子轻轻去除硬脑膜。
12. 对于刺激电极，以颅骨冠状缝后方5.2 mm、外侧1.0 mm处为中心，钻一个方形孔（前后方向2 mm，内外方向5 mm）。
13. 使用立体定位仪的臂杆，将双极刺激电极/导引套管 lowered 至硬脑膜下 5 mm。若在电极植入过程中发生出血，应使用无菌棉签和纱布尽量减少出血。
    注意： 本方法中使用的双极刺激电极已预先安装导向套管（材料清单）。使用该物品时，应将内部套管完全插入导向套管，使其与双极刺激电极的两个针脚对齐并冲洗。这将使内部套管直接位于刺激器两个相距约1 mm的针脚之间。类似的操作方案在其他文献中有描述。
14. 使用立体定位仪的臂杆，将碳纤维微电极降至硬脑膜下方 4 mm 处。该位置位于纹状体最背侧的部分。
15. 将参比电极导线和碳纤维连接到恒电位仪。
16. 施加三角波形电压（-0.4−1.3 V，400 V/s），在60 Hz下持续15分钟，随后在10 Hz下持续10分钟。
    注意： 通常，在向脑内碳纤维微电极施加波形时，碳纤维表面会生成氧化物基团。在记录信号前必须使该反应达到平衡，否则将产生显著的信号漂移19。以较高频率（60 Hz）对电极进行循环处理可使碳纤维更快达到平衡状态。

3. 优化碳纤维及刺激电极/引导套管的位置

1. 将刺激器设置为产生双极性电波形，频率为60 Hz，24个脉冲，电流为300 µA，脉冲宽度为2 ms/相。
2. 从硬脑膜下5 mm至7.8 mm处，以0.2 mm为增量逐步降低刺激器。在每个增量位置对VTA进行刺激。
   注意： 在更背侧的深度（5−6 mm），脑刺激通常（约80%的情况下）会引起大鼠胡须抽动。在更深的位置，胡须抽动将停止，这通常发生在硬脑膜下7.5−8.2 mm之间。当胡须停止抽动时，刺激电极即已接近或到达VTA。此现象并非在每只大鼠中都会出现，胡须无抽动不应被视为双极刺激电极/灌注套管位置错误的标志。此外，并非所有麻醉剂（例如异氟烷）下都会出现胡须抽动。
3. 继续降低双极刺激电极/引导套管，直至刺激引发伏隔核背侧部碳纤维微电极处出现相位性多巴胺（DA）释放。
   注意： 即使双极电极已植入VTA，伏隔核背侧部的DA释放也并不总是发生；但VTA刺激时若能在伏隔核背侧部观察到DA释放，通常表明在伏隔核核心区域也能记录到良好的信号。
4. 将碳纤维微电极下移，直至其位于硬脑膜下至少6.0 mm处。此位置为伏隔核核心区域最背侧的部分。
5. 刺激VTA，并记录DA峰值的峰值幅度。
6. 在产生最大DA释放的位置，调整碳纤维微电极的高度（降低或升高）。
7. 确保DA响应峰在0.6 V处呈现清晰的氧化峰，在-0.2 V处呈现还原峰。这些峰形特征提示检测到的是多巴胺（DA）。

4. 联合灌注与刺激的FSCV记录

注意：图1展示了VTA微量注射前后记录的时间线。

1. 在优化碳纤维和刺激电极/引导套管位置后，进行约20−30分钟的刺激。
   注意：在当前刺激参数下，为允许囊泡重新装载22，每3分钟内不得进行超过一次的刺激。
2. 在获得稳定基线后（在五次刺激中变化<20%），手动轻轻将内套管插入已预装在双极刺激器中的引导套管中。
3. 再进行2−3次基线记录，以确认内套管插入本身未改变诱发电信号。在某些情况下，插入或移除内套管可能会损伤腹侧被盖区（VTA）。如果在此基线期间信号发生显著变化（>20%），则需额外进行3−4次记录，直至基线重新稳定。
4. 使用注射泵和微量注射器，在2分钟内向VTA内灌注0.5 µL溶液（例如0.9%生理盐水、N-甲基-D-天冬氨酸[NMDA]、(2R)-氨基-5-磷酸戊酸[AP5]）。
5. 灌注后，内套管至少保留1分钟后再移除。
   注意：某些药物可能需要根据药物动力学延长内套管保留时间，过早移除内套管可能导致药物反流回套管内。如有疑虑，可在整个记录期间保留内套管在引导套管中。否则，可在1分钟后开始记录。
6. 继续每3分钟记录一次，以测量灌注后的效应。
   注意：若灌注的是对照溶液且未观察到效应，可考虑再次灌注10。若因插入内套管或灌注生理盐水导致多巴胺（DA）释放改变，信号通常在30分钟内恢复至基线水平。

结果

图1：VTA 微量输注前后记录的时间线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电极填充液/耗材
微量移液管	World Precision Instruments	MF286-5 (28 gauge)
乙酸钾	Sigma	236497-100G
氯化钾	Sigma	P3911-25G
电极耗材
碳纤维	Thornel	T650
电极拉制仪	Narishige International	PE-22	注：也可使用水平拉制仪
玻璃毛细管	A-M systems	626000
电极用绝缘导线	Weico Wire and Cable Incorporated	UL 1423	长度：10 cm；直径：0.4 mm；需定制；绝缘材料应覆盖导线5 cm长度
光学显微镜（用于观察和切割电极）	Fischer Scientific	M3700
插针	Phoenix Enterprises	HWS1646	用于焊接到绝缘电极导线和参比电极上；连接至前置放大器
腻子	Alcolin	23922-1003	切割碳纤维时用于固定电极
手术刀片	World Precision Instruments	500239	用于将碳纤维切割至适当长度
银丝	Sigma	327026-4G
FSCV 硬件/软件
法拉第屏蔽笼	U-Line	H-3618 (36" x 24" x 42")
恒电位仪	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
刺激电极	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	订购时请注明基座下方22 mm处切割
TarHeel HDCV 软件	University of North Carolina-Chapel Hill	-	订购信息请访问 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
UEI 接线盒	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility		订购信息请访问 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
UEI 电源	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility		订购信息请访问 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
刺激器硬件
Neurolog 刺激隔离器	Digitimer Ltd.	DS4	Neurolog 800A
输注/刺激耗材
输注泵	New Era Syringe Pump	NE-300
内插管	PlasticsOne	C315I/SPC INTERNAL 33GA
微升注射器	Hamilton	80308
导管	PlasticsOne	C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
手术耗材
插管固定器	Kopf Instruments	1776 P-1
棉签	Vitality Medical	806
电极固定器	Kopf Instruments	1770
加热垫	Kent Scientific	RT-0501
聚维酮碘	Vitality Medical	29906-004
螺钉	Stoelting	骨锚螺钉/每包100个	外径1.59 mm，长3.2 mm
镀银/氯化银参比电极	InVivo Metric	E255A
方纱布	Vitality Medical	441408
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 902 (双臂支架)
输注用药
((2R)-氨基-5-磷酸戊酸	Sigma Aldrich	A5282
N-甲基-D-天冬氨酸	Sigma Aldrich	M3262
美加明盐酸盐 (M9020-5mg)	Sigma Aldrich	M9020
氢溴酸东莨菪碱 (S0929-1g)	Sigma Aldrich	S0929