利用全细胞膜片钳技术测定生长激素对吻肽神经元的作用效果

摘要

来源：Silva, J. d. N.，等，下丘脑Kisspeptin神经元作为全细胞膜片钳记录的靶点。J. Vis. Exp. (2023)

本视频演示了使用全细胞膜片钳技术记录转染小鼠下丘脑脑片中kisspeptin神经元反应的方法。该过程包括建立全细胞记录构型，并利用电流钳模式记录由测试激素诱导的膜电位变化。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 记录用细胞封接

1. 确保在开始记录之前，所有设备（显微镜、放大器、数字转换器、显微操作器及其他设备）均已开启。
2. 填充记录室，来自商业品牌（材料表），将含aCSF溶液的装置连接至显微镜用于记录。使用灌流泵以2 mL/min的流速持续灌注aCSF。
3. 将感兴趣的脑切片（一次一片）转移至记录室。使用丙烯酸转移移液管（连接硅胶吸头的倒置巴斯德玻璃移液管）将下丘脑切片转移至记录室。使用切片固定器（材料表用以固定脑片，防止其在aCSF灌流过程中移动。
4. 将脑片置于显微镜上记录室的中央位置。脑片的位置至关重要，需确保在显微镜下能够清晰观察目标区域，同时便于记录微电极准确到达目标位置。
5. 使用浸入式显微镜的低倍物镜（10×或20×）辅助定位脑片并找到目标区域。
6. 在找到目标区域后，切换物镜至高倍镜（63倍），聚焦于组织层面，观察目标区域内内源性荧光蛋白及细胞形态，以定位脑片表面的kisspeptin细胞。
7. 当定位到可能的目标细胞时，使用鼠标光标或在感兴趣区域上绘制某种形状（如方形）在计算机屏幕上进行标记。屏幕上的标记有助于引导记录用微电极移至该细胞位置。
8. 在确定目标细胞的精确位置后，抬起物镜，插入装有内液的记录微电极。将微电极放入电极夹持器时，应确保内液与银电极接触。
   注意： 用于微量移液器的制备、放置及在电极架上的定位。
9. 在将微移液管浸入aCSF溶液之前，通过连接至微移液管持 holder 的聚乙烯管连接一个装有1–3 mL空气的注射器，施加正压，以防止碎屑进入微移液管≈130 厘米更长）；施加约 100–200 μ升空气
10. 使用显微操作仪，将微吸管引导至物镜中心下方。调节显微操作仪上的控制按钮，沿X-Y-Z轴方向移动微吸管，使其对准目标细胞。
11. 调节焦距以观察微移液管尖端，并将焦平面逐渐移近脑片，但不可过于接近。降低显微操作仪的速度，缓慢将微移液管下降至焦平面。确保微移液管尖端不会突然刺入脑片，而是缓慢下降直至接触细胞/目标区域表面。
12. 施加轻微的正压（≈100 μL）使用连接在微移液管支架上的1-3 mL空气填充注射器，清除进路中的任何碎屑。
13. 聚焦目标细胞，缓慢调节显微操作仪的X-Y-Z轴，使微吸管逐渐靠近细胞。当微吸管接触细胞时，可观察到微吸管尖端施加压力所致的细胞表面凹陷现象（图 2C).
14. 形成凹陷后，由于微吸管靠近细胞，通过连接微吸管持夹的管路用嘴施加微弱且短暂的负压（1–2 秒），以在微吸管与细胞之间形成封接（吉欧封接或千兆封接） >1 GΩ; 图 2D）。为形成封接，使用软件中的电压钳模式。
15. 如果封接保持稳定（吉欧封接应机械稳定且无噪声干扰，通过约1分钟的观察确定），将钳制电压设置为所研究细胞最接近的生理静息膜电位。对于下丘脑kisspeptin神经元，建议使用-50 mV。
16. 用微移液管封接细胞后，通过口吸施加短暂负压，以破裂细胞质膜（图2E当施加足够力度进行抽吸，使破裂的细胞膜不会堵塞微电极，且不会吸附大量膜碎片甚至整个细胞时，即形成良好的全细胞记录构型。
17. 查阅所使用的系统设置手册。使用软件（参见 材料表) 通过数字化方式检测并计算串联电阻（SR）和全细胞电容（WCC）。
18. 在电压钳模式下，破膜后启用全细胞选项，并点击全细胞标签页中的自动命令。细胞的串联电阻（SR）和全细胞电容（wcc）将由软件自动计算并实时显示。这些参数也可通过使用前述放大器执行膜电容测试进行验证。 材料表.
19. 务必检查细胞活力参数。对于吻肽神经元，需确认电生理测量指标为：SR < 25 mΩ，输入电阻 > 0.3 GΩ，以及保持电流的绝对值 < 30 pA。AVPV/PeN Kisspeptin 或 ARH Kisspeptin 神经元的 WCC 平均值为 ≈ 在性腺完整的 小鼠中为 10-12 pF。
20. 实验过程中监测串联电阻（SR）和细胞稳态电容。确保记录期间串联电阻变化不超过20%，且膜电容保持稳定。
21. 检查软件设置。根据实验类型创建相应的记录方案。使用前述设备，以电流钳模式记录膜电位。 材料表，将电生理信号以2-4 kHz进行低通滤波，并在软件中离线分析结果（参见 材料表 有关软件信息）。
22. 全细胞记录模式建立成功后，在电压钳模式下记录突触电流（图 2G）。在电流钳模式下记录静息膜电位（RMP）的变化以及诱导的RMP波动（图 2H）。通过向浴液中添加已知药物/神经递质（如步骤1.2所述），可诱导静息膜电位（RMP）的变化，例如细胞膜去极化，如图所示 图1.
    注意： 在电流钳模式下，可通过注入正电流或负电流将膜电位钳制在所需的电压水平。对于kisspeptin神经元，我们通常设置零电流注入（I = 0），以记录膜电位的自发性变化。

结果

图 1： 示意图总结了全细胞膜片钳技术在揭示 kisspeptin 神经元活动机制方面的贡献。 Kisspeptin 神经元（以绿色显示）位于下丘脑的前腹侧室周核和喙部室周核（AVPV/PeN）以及弓状核（ARH）。AVPV/PeNKisspeptin 和 ARHkisspeptin 神经元直接投射至位于视前区（POA）的促性腺激素释放激素（GnRH）神经元胞体及其在正中隆起（ME）的神经末梢，从而调控下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）。已有研究表明，多种神经调节物质（如激素）可差异性地调节 AVPV/PeNKisspeptin 和 ARHkisspeptin 神经元的活动。图中通过全细胞膜片...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液（aCSF）、细胞内液及切片溶液的化合物
ATP	Sigma Aldrich/各种	A9187
氯化钙	Sigma Aldrich/各种	C7902
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich/各种	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/各种	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/各种	H3375
KCl	Sigma Aldrich/各种	P5405
K-葡萄糖酸盐	Sigma Aldrich/各种	G4500
KOH	Sigma Aldrich/各种	P5958
氯化镁	Sigma Aldrich/各种	M9272
硫酸镁	Sigma Aldrich/各种	230391
NaCl	Sigma Aldrich/各种	S5886
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich/各种	S5011
碳酸氢钠	Sigma Aldrich/各种	S5761
设备
放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
DIGIDATA 1440 低噪声数据采集系统	Molecular Devices	DD1440
数字蠕动泵	Ismatec	ISM833C
法拉第笼	TMC	81-333-03
成像相机	徕卡	DFC 365 FX
显微操作仪	Sutter Instruments	Roe-200
微移液管拉制仪	Narishige	PC-10
显微镜	Leica	DM6000 FS
复苏室	Warner Instruments/Harvard apparatus	-
记录室	Warner Instruments	640277
刮勺	Fisher Scientific / 各种型号	FISH-14-375-10；FISH-21-401-20
软件与系统
AxoScope 10 软件	Molecular Devices	-	Commander 软件
LAS X 宽场成像系统	Leica	-	图像采集与分析
MultiClamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Commander 软件
适用于 Windows 系统的 PCLAMP 10 软件	Molecular Devices	Pclamp 10 标准版
工具
Ag/AgCl 电极，片状，1.0 mm	华纳仪器	64-1309
切片锚定	Warner Instruments	64-0246