来源：Silva, J. d. N.，等，下丘脑Kisspeptin神经元作为全细胞膜片钳记录的靶点。J. Vis. Exp. (2023)
本视频演示了使用全细胞膜片钳技术记录转染小鼠下丘脑脑片中kisspeptin神经元反应的方法。该过程包括建立全细胞记录构型，并利用电流钳模式记录由测试激素诱导的膜电位变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
利用全细胞膜片钳技术测定生长激素对吻肽神经元的作用效果
753 次观看
⸱
2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。
1. 记录用细胞封接
- 确保在开始记录之前，所有设备（显微镜、放大器、数字转换器、显微操作器及其他设备）均已开启。
- 填充记录室，来自商业品牌（材料表），将含aCSF溶液的装置连接至显微镜用于记录。使用灌流泵以2 mL/min的流速持续灌注aCSF。
- 将感兴趣的脑切片（一次一片）转移至记录室。使用丙烯酸转移移液管（连接硅胶吸头的倒置巴斯德玻璃移液管）将下丘脑切片转移至记录室。使用切片固定器（材料表用以固定脑片，防止其在aCSF灌流过程中移动。
- 将脑片置于显微镜上记录室的中央位置。脑片的位置至关重要，需确保在显微镜下能够清晰观察目标区域，同时便于记录微电极准确到达目标位置。
- 使用浸入式显微镜的低倍物镜（10×或20×）辅助定位脑片并找到目标区域。
- 在找到目标区域后，切换物镜至高倍镜（63倍），聚焦于组织层面，观察目标区域内内源性荧光蛋白及细胞形态，以定位脑片表面的kisspeptin细胞。
- 当定位到可能的目标细胞时，使用鼠标光标或在感兴趣区域上绘制某种形状（如方形）在计算机屏幕上进行标记。屏幕上的标记有助于引导记录用微电极移至该细胞位置。
- 在确定目标细胞....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图 1： 示意图总结了全细胞膜片钳技术在揭示 kisspeptin 神经元活动机制方面的贡献。 Kisspeptin 神经元（以绿色显示）位于下丘脑的前腹侧室周核和喙部室周核（AVPV/PeN）以及弓状核（ARH）。AVPV/PeNKisspeptin 和 ARHkisspeptin 神经元直接投射至位于视前区（POA）的促性腺激素释放激素（GnRH）神经元胞体及其在正中隆起（ME）的神经末梢，从而调控下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）。已有研究表明，多种神经调节物质（如激素）可差异性地调节 AVPV/PeNKisspeptin 和 ARHkisspeptin 神经元的活动。图中通过全细胞膜片.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人工脑脊液（aCSF）、细胞内液及切片溶液的化合物 | |||
| ATP | Sigma Aldrich/各种 | A9187 | |
| 氯化钙 | Sigma Aldrich/各种 | C7902 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma Aldrich/各种 | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/各种 | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/各种 | H3375 | |
| KCl | Sigma Aldrich/各种 | P5405 | |
| K-葡萄糖酸盐 | Sigma Aldrich/各种 | G4500 | |
| KOH | Sigma Aldrich/各种 | P5958 | |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich/各种 | M9272 | |
| 硫酸镁 | Sigma Aldrich/各种 | 230391 | |
| NaCl | Sigma Aldrich/各种 | S5886 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma Aldrich/各种 | S5011 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich/各种 | S5761 | |
| 设备 | |||
| 放大器 | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| DIGIDATA 1440 低噪声数据采集系统 | Molecular Devices | DD1440 | |
| 数字蠕动泵 | Ismatec | ISM833C | |
| 法拉第笼 | TMC | 81-333-03 | |
| 成像相机 | 徕卡 | DFC 365 FX | |
| 显微操作仪 | Sutter Instruments | Roe-200 | |
| 微移液管拉制仪 | Narishige | PC-10 | |
| 显微镜 | Leica | DM6000 FS | |
| 复苏室 | Warner Instruments/Harvard apparatus | - | |
| 记录室 | Warner Instruments | 640277 | |
| 刮勺 | Fisher Scientific / 各种型号 | FISH-14-375-10；FISH-21-401-20 | |
| 软件与系统 | |||
| AxoScope 10 软件 | Molecular Devices | - | Commander 软件 |
| LAS X 宽场成像系统 | Leica | - | 图像采集与分析 |
| MultiClamp 700B | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Commander 软件 |
| 适用于 Windows 系统的 PCLAMP 10 软件 | Molecular Devices | Pclamp 10 标准版 | |
| 工具 | |||
| Ag/AgCl 电极，片状，1.0 mm | 华纳仪器 | 64-1309 | |
| 切片锚定 | Warner Instruments | 64-0246 |
