基于微电极阵列的小鼠脊髓切片神经元网络评估

摘要

来源：Iredale, J. A., 等。使用微电极阵列记录脊髓伤害性感觉回路中的网络活动。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种基于微电极阵列的检测方法，用于研究小鼠脊髓切片中神经元网络的活动。首先，记录切片浅层背角（SDH）的电生理活动；随后引入钾通道抑制剂以延长去极化过程，从而在神经元网络中引发同步的节律性活动。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 体外 电生理学

1. 脊髓切片制备与记录用溶液的配制
   1. 人工脑脊液
      ​注意：人工脑脊液（aCSF）用于界面式孵育室，切片在记录开始前以及实验过程中均保存于此，并用作灌流液和药物的稀释剂。详细成分见表1。
2. 通过将上述试剂（除CaCl₂外）按以下浓度加入2 L蒸馏水中，配制含有（单位为mM）118 NaCl、25 NaHCO₃、10葡萄糖、2.5 KCl、1 NaH₂PO₄、1 MgCl₂和2.5 CaCl₂的aCSF溶液。
3. 将上述溶液用碳氧混合气体（95% O₂，5% CO₂）鼓泡5分钟，然后加入CaCl₂。
   注意：此步骤可防止CaCl₂沉淀，即溶液不应变浑浊。实验中给药时，将药物储备液用aCSF稀释至所需终浓度。

2. 蔗糖替代的人工脑脊液

注意：在解剖和脊髓切片过程中使用蔗糖替代的 aCSF。正如其名称所示，用蔗糖替代 NaCl 可在保持渗透压的同时，减少这些操作过程中的神经元兴奋。详细成分见表1。

1. 通过将除 CaCl₂ 外的所有上述成分按所需量加入 300 mL 蒸馏水中，配制含（单位为 mM）250 蔗糖、25 NaHCO₃、10 葡萄糖、2.5 KCl、1 NaH₂PO₄、1 MgCl₂ 和 2.5 CaCl₂ 的蔗糖替代 aCSF。
2. 用碳氧混合气（carbogen）对该溶液充气 5 分钟，然后加入 CaCl₂。
3. 将该溶液置于 -80 °C 冰箱中保存约 40 分钟，或直至溶液形成浆状物。避免完全冻结，使用时应保持浆状一致性。

3. 微电极阵列制备

注意：MEA 的接触表面需要进行预处理，以使其具有亲水性。

1. 实验前，向MEA孔中加入胎牛血清（FBS）或马血清（HS），孵育30分钟。
2. 移除FBS或HS，并用约五次蒸馏水彻底冲洗MEA，直至蒸馏水不再产生泡沫。用aCSF填充孔内，备用。

4. 急性脊髓切片制备

1. 通过腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮使小鼠深度麻醉，然后使用大型手术剪进行断头。
2. 在髋部水平的腹侧皮肤上做一个小切口，以去除腹部区域的皮肤。将切口两侧的皮肤向头侧方向拉伸，直至完全去除从肋骨顶部到骨盆顶部（包括腹侧和背侧）的所有皮肤。
3. 将尸体置于冰上，采用腹侧入路，通过移除所有内脏及沿胸骨外侧剪断肋骨，暴露脊柱。
4. 去除腹侧肋骨笼、两侧肩胛骨（在约 T2 水平处切断）以及下肢和骨盆（在约骶骨顶部处切断）。
5. 将脊柱和肋骨标本转移至含有冰冻蔗糖人工脑脊液（aCSF）的解剖浴槽中。通过穿过下背部肌肉及相连的上部肋骨插入固定针，将标本的四个角固定（腹面朝上）。
6. 使用咬骨钳去除覆盖在椎体腹侧表面的所有肌肉和结缔组织，并识别位于腰骶膨大区域对应的椎体段，该区域大致位于 T12 至 L2 椎体下方。
7. 切除位于腰骶膨大区域尾侧的一个椎体，以暴露位于椎管内的脊髓。
8. 使用弯头弹簧剪，在将椎体向头侧提起并牵拉的同时，双侧剪断椎弓根，从而分离椎体的腹侧和背侧部分，暴露脊髓。
9. 当椎体被切除并暴露出腰骶膨大后，使用弹簧剪小心清除固定脊髓的剩余神经根，直至脊髓完全游离。
10. 在腰骶膨大区域的头侧和尾侧足够远的位置切断脊髓，使目标节段的脊髓“完全游离”。
    注意： 所需切片的方向将决定脊髓后续固定用于切片的方式（图 1）。
11. 对于横切片，通过附着的神经根提起腰骶节段，并将其放置在一个预先切割好的聚苯乙烯（Styrofoam）块（1 cm × 1 cm × 1 cm）上，该块中心有一浅槽。使用氰基丙烯酸酯粘合剂（参见材料表）将标本和聚苯乙烯块固定在切片平台上，并将其放入含有冰冻蔗糖人工脑脊液（aCSF）（冰浆）的切片浴槽中。
    注意： 浅槽有助于固定和定向脊髓，使背侧向上，脊髓的胸段端位于聚苯乙烯块底部。
12. 对于矢状切片，在切片平台上涂抹一条细的氰基丙烯酸酯粘合剂。通过附着的神经根提起腰骶膨大，并将脊髓沿胶线放置，确保一侧的外侧面粘附在胶中，另一侧向上。将其放入含有冰冻蔗糖人工脑脊液（aCSF）（冰浆）的切片浴槽中。
13. 对于水平切片，在切片平台上涂抹一条细的氰基丙烯酸酯粘合剂。通过附着的神经根提起腰骶膨大，并将腰骶膨大沿胶线放置，确保腹侧表面粘附在胶中，背侧表面向上。利用附着的神经根调整脊髓的位置。将其放入含有冰冻蔗糖人工脑脊液（aCSF）（冰浆）的切片浴槽中。

5. 微电极阵列记录

注意：以下步骤详细说明了如何从脊髓切片的多电极阵列（MEA）实验中记录数据。可根据实验需求选用多种MEA设计。本实验所用MEA的设计细节见表2和图2。平面型MEA和三维（3D）MEA的详细设计信息分别由Egert et al. 和 Thiebaud et al. 发表。两种类型的MEA均由60个氮化钛电极构成，带有氮化硅绝缘层以及氮化钛导轨和接触焊盘。

1. 实验设置
   1. 打开计算机和接口板，并启动记录软件。
   2. 加载预先组装的记录模板（图3A）。在记录器选项卡中为当天的文件命名。
   3. 在整个实验过程中，持续用碳合气（5% CO₂，95% O₂）向aCSF通气。
   4. 开启灌流系统，该系统由蠕动泵控制。将进液管插入aCSF中，出液端放入废液杯中。用aCSF预充灌流管路。
   5. 通过将储备液稀释至50 mL aCSF中，配制4-AP及其他药物溶液至所需终浓度（例如，4-AP为200 µM）。
2. 4-氨基吡啶（4-AP）诱导的活动
   1. 孵育结束后，使用装有aCSF的大口径巴斯德移液管将单个脑片从孵育器中转移出来。
   2. 将脑片放入MEA井中，并加入额外的aCSF。
   3. 使用细短毛画笔将脑片定位在60通道电极记录阵列上方。避免画笔接触电极或将组织在电极表面拖动，尤其是在使用三维阵列时。
      注意：根据MEA的布局，此步骤可在显微镜辅助下或不借助显微镜进行，以实现精确定位。
   4. 放置脑片后，将一个带重物的网状固定器覆盖在组织上，以固定其位置并促进脑片与MEA电极的良好接触。
      注意：放置固定网后可能需要重新调整脑片位置。
   5. 将MEA放入记录探头中（图2A, B）。
   6. 使用倒置显微镜（2倍放大）检查脑片在电极上的位置，确保尽可能多的电极位于浅层背角（SDH）下方。确保至少有2–6个电极不与脑片接触，这些电极在后续数据分析中用于扣除噪声和记录伪迹（图2E）。
   7. 打开相机并连接至设备，拍摄脑片相对于MEA的参考图像，供后续分析使用。
   8. 在记录软件中点击开始DAQ（数据采集），并确认所有电极均接收到清晰信号。
      注意：如果信号噪声较大，断开探头连接，用70%乙醇清洁MEA接触垫和金质弹簧触点（使用实验室擦拭纸确保清洁后垫片和触点完全干燥）。若信号仍存在噪声，可在记录软件中关闭故障电极，或记录下来以便后续分析时排除。
   9. 将灌流系统的进液管和出液管连接至MEA井（此前已充满aCSF），并开启灌流系统。检查流速，理想情况下为每分钟4–6倍浴液体积，并确保流出量充足，防止灌流液溢出。
   10. 让组织平衡5分钟，然后记录5分钟原始未滤波的基线数据。
   11. 将灌流进液管从aCSF切换至4-AP溶液，等待12分钟，使4-AP诱导的节律性活动达到稳态（2分钟使药物进入浴槽，10分钟使活动达到峰值并趋于平稳）。
   12. 记录5分钟的4-AP诱导活动。准备好进行后续记录，以测试其他药物或检测4-AP活动的稳定性。

表1：人工脑脊液成分。

化学物质	aCSF (mM)	aCSF (g/100 mL)	蔗糖替代aCSF (mM)	蔗糖替代aCSF (g/100 mL)	高钾aCSF (mM)	高钾aCSF (g/100 mL)
氯化钠 (NaCl)	118	0.690	-	-	118	0.690
碳酸氢钠 (NaHCO3)	25	0.210	25	0.210	25	0.210
葡萄糖	10	0.180	10	0.180	10	0.180
氯化钾 (KCl)	2.5	0.019	2.5	0.019	4.5	0.034
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)	1	0.012	1	0.012	1	0.012
氯化镁 (MgCl2)	1	0.01	1	0.01	1	0.01
氯化钙 (CaCl2)	2.5	0.028	2.5	0.028	2.5	0.028
蔗糖	-	-	250	8.558	-	-

表2：微电极阵列布局。

微电极阵列布局
微电极阵列型号	60MEA 200/30iR-Ti	60-3DMEA 100/12/40iR-Ti	60-3DMEA 200/12/50iR-Ti	60MEA 500/30iR-Ti
平面型或三维（3D）	平面型	三维	三维	平面型
电极网格	8 × 8	8 × 8	8 × 8	6 × 10
电极间距	200 µm	100 µm	200 µm	500 µm
电极直径	30 µm	12 µm	12 µm	30 µm
电极高度（3D）	N/A	40 µm	50 µm	N/A
实验类型	横切片	横切片	矢状面 + 水平面	矢状面 + 水平面

结果

图1：脊髓切片的方向、固定与切割方法。（A）制备横切面切片时，需使用带有支撑凹槽的泡沫塑料切割块。将脊髓置于切割块的凹槽内，脊髓背侧朝上，远离切割块。用氰基丙烯酸盐胶水将切割块和脊髓一起粘附于切片台上。（B）制备矢状面切片时，先在切片台上涂一条薄层氰基丙烯酸盐胶水，然后将脊髓侧放于胶水上。（C）制备水平切面切片时，先在切片台上涂一条薄层氰基丙烯酸盐胶水，然后将脊髓腹侧朝下置于胶水上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-氨基吡啶	Sigma-Aldrich	275875-5G
100% 乙醇	赛默飞世尔科技	AJA214-2.5LPL
CaCl2 1M	Banksia Scientific	0430/1L
Carbonox（碳酰气——95% O₂ 和 5% CO₂）2，5% CO₂2)	Coregas	219122
弯头长柄弹簧剪	Fine Science Tools	15015-11
定制气液界面培养室
胎牛血清	赛默飞世尔科技	10091130
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-30
葡萄糖	赛默飞世尔科技	AJA783-500G
马血清	赛默飞世尔科技	16050130
倒置显微镜	Zeiss	Axiovert10
KCl	Thermo Fisher	AJA383-500G
氯胺酮	Ceva	KETALAB04
大型手术剪	Fine Science Tools	14007-14
Loctite 454 瞬干胶	螺栓与工业用品	L4543G
MATLAB	MathWorks		R2018b
多电极阵列，三维	多通道系统	60-3DMEA100/12/40iR-Ti，60-3DMEA200/12/50iR-Ti	60个氮化钛（TiN）电极，含1个内部参比电极，排列成8×8的方形网格。电极直径为12 µm，高度为40 µm（100/12/40）或50 µm（200/12/50），电极间距均匀，分别为100 µm（100/12/40）或200 µm（200/12/50）。
MEA前置放大器	多通道系统	MEA2100-HS60
MEA接口板	多通道系统	MCS-IFB 3.0 多重启动
MEA 网络	多通道系统	ALA HSG-MEA-5BD
MEA灌流系统	多通道系统	PPS2
多电极阵列，平面型	多通道系统	60MEA200/30iR-Ti，60MEA500/30iR-Ti	60个氮化钛（TiN）电极，含1个内部参比电极，排列成8×8方形阵列（200/30）或6×10矩形阵列（500/30）。电极直径为30 µm，间距分别为200 µm（200/30）或500 µm（500/30），均匀分布。
MgCl₂2	赛默飞世尔科技	AJA296-500G
显微镜相机	Motic	Moticam X Wi-Fi
多通道分析仪软件	多通道系统		V 2.17.4
多通道实验者软件	多通道系统		V 2.17.4
NaCl	赛默飞世尔科技	AJA465-500G
NaHCO₃3	赛默飞世尔科技	AJA475-500G
NaH2PO4	赛默飞世尔科技	ACR207805000
咬骨钳	Fine Science Tools	16021-14
小型弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09
小型手术剪	精细科学工具	14060-09
蔗糖	赛默飞世尔科技	AJA530-500G
超级胶水			氰基丙烯酸酯粘合剂
河豚毒素	Abcam	AB120055
减振台	纽波特	VH3048W-OPT
振动切片机	Leica	VT1200 S