基于微电极阵列的小鼠脊髓切片神经元网络评估

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 体外电生理学

1. 制备用于脊髓切片制备和记录的溶液
   1. 人工脑脊液
      注意:人工脑脊液 （aCSF） 用于界面培养室，切片储存在记录开始之前，在实验期间用作药物的灌注液和稀释剂。详细组成见表 1。
2. 通过将所需数量的上述物质（不包括 CaCl₂）添加到 2 L 蒸馏水中，制备含有（以 mM 为单位）118 NaCl、25 NaHCO₃、10 葡萄糖、2.5 KCl、1 NaH₂、PO₄、1 MgCl₂ 和 2.5 CaCl₂ 的 aCSF。
将
3. 上述溶液与碳化物（95% O₂、5% CO₂ ）鼓泡 5 分钟，然后加入 CaCl₂.
   注意:此步骤可防止 CaCl₂ 沉淀，即溶液不应变得浑浊。对于实验期间的药物应用，将 aCSF 中的药物储备溶液稀释至所需的最终浓度。

2. 蔗糖替代人工脑脊液

注意:蔗糖取代的 aCSF 用于解剖和脊髓切片。顾名思义，蔗糖取代了 NaCl，以减少这些过程中的神经元兴奋，同时保持渗透压。详细组成见表 1。

1. 通过将所需数量的上述所有物质（不包括 CaCl₂）添加到 300 mL 蒸馏水中，制备含有（以 mM 为单位）250 蔗糖、25 NaHCO₃、10 葡萄糖、2.5 KCl、1 NaH₂PO₄、1 MgCl₂ 和 2.5 CaCl₂ 的蔗糖替代 aCSF。
2. 将溶出剂溶液泡 5 分钟，然后加入 CaCl₂。
3. 将溶液储存在 -80 °C 冰箱中约 40 分钟或直到溶液形成浆液。避免凝固并在浆料稠度时使用。

3. 微电极阵列制备

注:MEA 的接触面需要预处理以使其具有亲水性。

1. 实验前，用胎牛血清 （FBS） 或马血清 （HS） 填充 MEA 孔 30 分钟。
2. 去除 FBS 或 HS，用蒸馏水清洗大约 5 次彻底冲洗 MEA，直到蒸馏水不再起泡。用 aCSF 填充孔，以备使用。

4. 急性脊髓切片制备

1. 用 100 mg/kg 氯胺酮 （ip） 深度麻醉小鼠，然后用大手术剪刀将其斩首。
2. 通过在臀部水平的皮肤上做一个小切口来去除腹部区域的皮肤。向嘴部拉动切口两侧的皮肤，直到去除所有皮肤，即从胸腔顶部到骨盆顶部（腹侧和背侧）。
3. 将身体放在冰上，并使用腹侧方法通过去除所有内脏并切开胸骨外侧的肋骨来露出脊柱。
4. 切除腹侧肋骨、两个肩胛骨（在大约 T2 处切断）以及下肢和骨盆（在大约骶骨顶部切断）。
5. 将脊柱和肋骨制备转移到含有冰冷蔗糖 aCSF 的解剖浴中。通过将销钉穿过下背部肌肉和连接的上肋骨，将准备物的所有四个角（腹面向上）固定。
6. 去除覆盖在椎骨腹面上的所有肌肉和结缔组织，并确定腰骶部扩大的椎体区域，该区域大约位于 T12 至 L2 椎体下方。
7. 切除位于腰骶部扩大区域尾部的椎体，以便在脊髓位于椎管中时提供进入脊髓的通道。
8. 使用弯曲的弹簧剪刀，在双侧切开椎弓根，同时向嘴部抬起和拉动椎体，以分离椎骨的腹侧和背侧，并暴露脊髓。
9. 一旦椎体被切除以露出腰骶部扩大，用弹簧剪刀小心地清除固定脊髓的剩余根部，直到脊髓自由漂浮。
10. 在腰骶部扩大的上方和下方，用嘴部和尾部切口隔离脊髓，使脊髓的目标区域"自由漂浮><"。 注意:首选的切片方向将决定随后如何安装脊髓以进行切片（图 1）。
11. 对于横向切片，通过附着的根部提起腰骶段，并将其放在预先切割的聚苯乙烯（聚苯乙烯泡沫塑料）块（1 厘米 x 1 厘米 x 1 厘米）上，并在中心切开一个浅通道。使用氰基丙烯酸酯胶粘剂（见材料表）将块和绳索连接到切片平台上，并将其放入含有冰冷蔗糖 aCSF（浆料）的切割槽中><。 注意: 浅通道有助于固定和定向脊髓，脊髓背侧暴露，脊髓的胸端位于阻滞的底部。
12. 对于矢状切片，在切片平台上铺设一条细线氰基丙烯酸酯胶粘剂，通过附着的根部抬起腰骶部扩大，并沿着胶水线放置绳索，确保一个侧面在胶粘剂中，另一个表面朝上。将其放入含有冰冷蔗糖 aCSF（浆液）的切割槽中。
13. 对于水平切片，在切片平台上放一条细线氰基丙烯酸酯粘合剂。通过附着的根部提起腰骶部扩大，并沿着粘合剂线放置腰骶部扩大，确保腹面在粘合剂中，背表面朝上。使用连接的根来定位绳索。将其放入含有冰冷蔗糖 aCSF（浆液）的切割槽中。

5. 微电极阵列记录

注意:以下步骤详细介绍了如何在脊髓切片上使用基于 MEA 的实验的记录数据。根据实验的不同，可以使用多种 MEA 设计。这些实验中使用的 MEA 的设计细节如表 2 和图 2 所示。Egert 等人和 Thiebaud 等人分别发表了平面和 3 维 （3D） MEA 的详细设计信息。两种 MEA 类型均由 60 个氮化钛电极组成，具有氮化硅绝缘层和氮化钛轨道和接触垫。

1. 实验装置
   1. 打开电脑和接口板，启动录音软件。
   2. 加载预组装的录音模板（图 3A）。在 recorder （录制器） 选项卡中为当天的文件命名。
   3. 在实验期间，用碳化物（5% CO 2,95% O₂ ）连续鼓泡 aCSF。
   4. 打开由蠕动泵控制的灌注系统。将入口管路放入 aCSF 中，将入口端放入废烧杯中。用 aCSF 灌注灌注管线。
   5. 通过将 50 mL aCSF 中的原液稀释至所需的终浓度（例如，4-AP 为 200 μM）来制备 4-AP 和任何其他药物溶液。
2. 4-氨基吡啶 （4-AP） 活性
   1. 孵育后，使用装满 aCSF 的大头巴斯德移液器从培养箱中转移单片。
   2. 将切片放入 MEA 孔中并添加额外的 aCSF。
   3. 使用细短毛画笔将切片定位在 60 电极记录阵列上。避免用画笔接触电极或在电极上拖动组织，尤其是在使用 3D 阵列时><。 注意:根据 MEA 布局，可以在有或没有显微镜协助的情况下完成此作，以实现精确定位。
   4. 放置切片后，在组织上放置一个加重的网以将其固定到位并促进与 MEA 电极的良好接触。
      注意: 切片在网络放置后可能需要重新定位。
   5. 将 MEA 放在记录头级中（图 2A、B）。
   6. 使用倒置显微镜（2 倍放大倍率）检查组织在电极上的位置，以确认尽可能多的电极位于浅表背角 （SDH） 下。确保至少 2-6 个电极不接触切片，因为这些电极对于在分析过程中减去噪声和记录伪影很重要（图 2E）。
   7. 打开相机，将其连接到设备，然后拍摄相对于 MEA 的切片参考图像，以便在分析期间使用。
   8. 在记录软件中按开始 DAQ（数据采集）并确认所有电极都接收到清晰的信号><。 注意:如果信号有噪音，请松开头巾，并用 70% 乙醇清洁 MEA 接触垫和金弹簧触点（使用实验室擦拭剂确保清洁后垫和触点干燥）。如果信号仍然有噪音，请在记录软件中关闭出现故障的电极，或记下以便稍后在分析过程中排除。
   9. 将灌注入口和出口管路连接到 MEA 孔（之前填充有 aCSF）并打开灌注系统。检查流速，最好是每分钟 4-6 个浴液体积，并确保流出量足以防止超级熔渣溢出。
   10. 让组织平衡 5 分钟，然后记录 5 分钟的原始、未过滤的基线数据。
   11. 将灌注入口管线从 aCSF 移至 4-AP 溶液中，并等待 12 分钟，使 4-AP 诱导的节律活动达到稳定状态（药物到达浴 2 分钟，活动达到峰值 10 分钟，然后达到平台）。
   12. 记录 5 分钟的 4-AP 诱导活性。为后续记录做好准备，以测试药物或检查 4-AP 的稳定性。

表 1:人工脑脊液成分。

表 2:微电极阵列布局。

图 1:脊髓切片的方向、安装和切割方法。 （A） 横向切片需要一个聚苯乙烯泡沫塑料切割块，上面有一个支撑槽。脊髓靠在支撑槽中的阻滞上，脊髓的背侧背对阻滞。用氰基丙烯酸酯胶粘剂将块和绳子粘在切割台上。（B） 通过在切割阶段放置一条细线氰基丙烯酸酯胶粘剂，然后将脊髓侧卧在胶水上来制备矢状切片。（C） 通过在切割阶段放置一条细线氰基丙烯酸酯胶粘剂，然后将脊髓腹侧朝下放在胶水上来制备水平切片。

图 2:微电极阵列上的组织定位。（A） 图像显示了一个开放的 MEA 头级，其中 MEA 放置在适当的位置。（B） 与 A 相同，MEA 头台关闭以进行记录并安装组织灌注系统。（C） 图像显示了制造商提供的 MEA。图中显示了与头部的金弹簧相连接的接触垫，以及容纳组织浴液和组织切片的 MEA 组织浴。中心红色方块突出显示的区域是电极阵列的位置。（D） 示意图显示了本研究中使用的两种 MEA 电极配置，表 2 中提供了更多详细信息。参比电极用蓝色梯形表示。左侧 MEA 电极布局显示了 60 电极的方形配置，最常用于所展示的工作模型 60MEA200/30iR-Ti，其中 30 μm 直径的电极间距为 200 μm，间距为 200 μm，间距为 200 μm 且间距为 100 μm 的三维 MEA（60MEA200/12/50iR-Ti 和 60MEA100/12/40iR-Ti），电极直径为 12 μm，高度为 50 μm 或 40 μm， 分别。左侧 MEA 电极布局显示了 6 x 10 电极矩形布局 - 60MEA500/30iR-Ti。（E） 60MEA100/12/40iR-Ti 方形 MEA 的高放大倍率图像，其中横脊髓切片定位用于记录。切片位于电极第 3-8 行。顶排电极不接触任何组织，用作参比电极。SDH 区域显示为半透明条带。在这种情况下，SDH 覆盖在 MEA 的第 4、5 和 6 行以及第 2、3、4、5 和 7 列的电极上。比例尺 = 200 μm。缩写: MEA = 微电极阵列;SDH = 浅表背角。

图 3:数据记录和分析工具布局以及显示细胞外动作电位和局部场电位波形的微电极阵列记录示例。（A） 示意图显示了用于采集 MEA 数据的预配置记录模板。将 MEA2100 和 recording （headstage/amplifier） 工具连接起来，可以命名和保存数据。一个 MEA 通道收集了原始数据的四个示例轨迹（右，5 分钟时期），显示基线、4-AP 应用后 12 分钟、建立 4-AP 活性后 15 分钟以及 TTX 沐浴后 （1 μM） 的活性。请注意，添加 4-AP（第二条跟踪）会导致背景噪声和 EAP/LFP 活动明显增加。重要的是，在建立 4-AP 诱导的活性后，活性至少保持相对稳定（第三条迹线）。添加 TTX （1 μM） 会消除所有活性（底部迹线）。（B） 示意图（左）显示了用于数据分析的分析仪软件配置。原始数据浏览器工具用于导入录制软件收集的录音。然后，这些数据通过跨通道滤波器工具运行，该工具从其他电极中减去选定的参比电极信号，以消除背景噪声。数据通过 EAP 滤波器和 LFP 滤波器工具，以优化每个波形的信噪关系。按照此步骤，EAP 路径数据进入 EAP 检测器工具，其中设置了阈值。检测到 EAP，然后将其发送到 EAP 分析器工具，在那里记录每个事件的延迟并将其导出为 txt。文件。使用相应的 LFP 工具包的 LFP 数据将发生相同的工作流程。右侧迹线显示来自包含各种细胞外波形的单个 MEA 通道的数据。EAP 和 LFP 信号的位置在上面的"计数栅格"中突出显示。下部迹线是上部记录的纪元（用红条表示），在扩展的时间尺度上显示波形，包括各种 LFP 信号（注意外观的多样性）和单个细胞外 EAP（红色圆圈）。请注意，LFP/EAP 波形和极性相对于产生这些信号的神经元的数量、它们与记录电极的接近程度以及它们相对于附近电极的位置而变化。缩写: MEA = 微电极阵列;EAP = 细胞外动作电位;LFP = 局部场电位;4-AP = 4-氨基吡啶;TTX = 河豚毒素。